醉魚草果實水部位化學成分及神經(jīng)保護活性研究

張 偉，許雙旺，吳德玲*，王桐生，許鳳清,2,3，陳簫簫

1安徽中醫(yī)藥大學藥學院；2中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室；3安徽省高?？蒲袆?chuàng)新平臺團隊—中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制一體化關鍵技術研究創(chuàng)新團隊；4安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥230012

醉魚草果實是馬錢科醉魚草屬植物醉魚草(BuddlejalindleyanaFort.)的果實。醉魚草為多年生小灌木，廣泛分布于長江以南地區(qū)，傳統(tǒng)認為其具有祛風除濕、行氣化痰、散瘀之功效[1]。近年來通過對醉魚草全草、果實的研究發(fā)現(xiàn)，醉魚草(包括果實)中主要含有黃酮類，三萜類，環(huán)烯醚萜苷類等成分，而且具有抗菌殺蟲、保肝、解痙、鎮(zhèn)靜、抗氧化、利尿等生物活性[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其中的部分成分具有保護腦神經(jīng)細胞，避免其受MPP+所致的損傷作用，預示其在抗帕金森病藥物的研究中具有一定的應用前景。本文主要對安徽歙縣產(chǎn)醉魚草(B.lindleyana)果實經(jīng)石油醚、乙酸乙酯等有機溶劑萃取后的水溶性部位進行了化學成分研究，并采用MPP+誘導的SH-SY5Y細胞模型對部分化合物的神經(jīng)保護作用進行了活性篩選研究。

1 材料與儀器

BruckerAM-400/600 MHz型超導核磁共振儀(Bruker，Bremerhaven，德國)。中壓制備液相色譜儀(DrFlash-S系列，上海利穗科技有限公司，分離柱為SepaFlash預裝柱：DN50×500 mm，40×400 mm，40×250 mm)；高壓制備液相色譜儀(Waters 2545，美國Waters公司)；SephadexLH-20(50 μm，GE公司)；反相材料RP-18(50 μm，Merck公司)；YMC-PackODS-A，(250 mm×20 mm，5 μm，YieldMicroelectronicsCorp.)；大孔樹脂(AB-8，天津光復精細化工研究所)；柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；薄層色譜用硅膠板(G、GF254，青島海洋化工廠)；Milli-Q超純水器(美國Millipore)；甲醇、乙腈為色譜純(OCEANPAK)；乙醇為食用酒精；水為蒸餾水；其它試劑均為分析純(天津市大茂化學試劑廠)。

胎牛血清(德國Serana公司)；胰蛋白酶(美國Sigma公司)；二甲基亞颯(DMSO，BestBio貝博)；噻唑藍(MTT，美國Sigma)；1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+，Sigma公司)；潔凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇凈安泰)；5% CO2細胞培養(yǎng)箱(371直熱式，Thermo公司，美國)；AIRTECH倒置顯微鏡(XSP-15CE，上海立光精密儀器有限公司)。

醉魚草果實采自安徽省歙縣，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學藥學院劉守金教授鑒定為馬錢科醉魚草(BuddlejalindleyanaFort.)的果實，原植物標本(編號：AZYZYC-SX-02)存放于安徽中醫(yī)藥大學藥學院中藥化學教研室；人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y細胞)由中科院上海細胞生物學研究所提供。

2 提取與分離

醉魚草果實(10 kg)粉碎成粗粉后，采用乙醇-水(95∶5，50∶50)依次滲漉提取，滲漉液合并后減壓濃縮至無醇味，加入水分散，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后剩的水層離心后取上清液，蒸干得到C部位(3.5 kg)。將C部位水溶解后經(jīng)AB-8大孔樹脂(600×250 mm)吸附后，以乙醇-水梯度洗脫，得到0%、30%、60%和90%乙醇洗脫部位。取大孔樹脂30%乙醇-水洗脫部位504 g以聚酰胺柱色譜(600×200 mm)分離，乙醇-水(0∶100，30∶70，60∶40，95∶5)梯度洗脫，依次得到四個洗脫流份，分別為C2-1、C2-2、C2-3、C2-4。

取C2-2(34 g)，經(jīng)硅膠柱色譜(250×100 mm)吸附，使用二氯甲烷-甲醇(95∶5，90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，50∶50，0∶100)梯度洗脫，TLC檢識合并得到流份C2-2-1和C2-2-2。對C2-2-1流份反復使用Sephadex LH-20柱色譜及ODS反相柱色譜進行細分、純化后，得化合物1(17 mg)。C2-2-2經(jīng)反復Sephadex LH-20柱色譜、ODS反相柱色譜(甲醇-水系統(tǒng))及高壓制備液相色譜(甲醇-水系統(tǒng))處理后，得化合物2(8 mg)和3(11 mg)。

取C2-1(367 g)，經(jīng)硅膠柱色譜充分吸附后，使用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，各流份經(jīng)TLC檢識后合并，得到C2-1-1～C2-1-6共六個部分。C2-1-1經(jīng)反復硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、ODS反相柱色譜處理，得化合物4(17 mg)，5(24 mg)，6(19 mg)。C2-1-2經(jīng)反復Sephadex LH-20柱色譜、硅膠柱色譜、ODS反相柱色譜及高壓制備液相色譜處理，得化合物7(41 mg)，8(10 mg)。C2-1-4借助中壓制備色譜，利用甲醇-水(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50，60∶40，100∶0)梯度洗脫，得到C2-1-4-1～C2-1-4-6共6個流份，其中C2-1-4-3經(jīng)反復ODS反相柱色譜及高壓制備液相色譜純化，得化合物9(6 mg)。C2-1-3經(jīng)MCI柱色譜處理后，以甲醇-水(10∶90，15∶85，20∶80，25∶75，30∶70，100∶0)梯度洗脫，得到C2-1-3-1和C2-1-3-2兩個部位，其中C2-1-3-1經(jīng)常壓ODS反相柱色譜和高壓制備液相色譜純化，得化合物10(8 mg)。

3 結(jié)構(gòu)解析

化合物1 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，pyridine-d5)δH：5.63(1H，d，J=11.3 Hz，H-11)，6.62(1H，dd，J=10.8，2.8 Hz，H-12)，4.94(1H，d，J=7.9 Hz，H-1′)，5.29(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′′)，5.60(1H，d，J=7.9 Hz，H-1′′′)，5.79(1H，d，J=8.2 Hz，H-1′′′′);13C NMR(150 MHz，pyridine-d5)δ：38.6(C-1)，26.1(C-2)，82.6(C-3)，43.8(C-4)，47.7(C-5)，18.6(C-6)，32.5(C-7)，40.5(C-8)，54.8(C-9)，36.5(C-10)，126.4(C-11)，125.9(C-12)，136.3(C-13)，42.5(C-14)，33.0(C-15)，24.7(C-16)，40.6(C-17)，135.7(C-18)，38.3(C-19)，32.5(C-20)，35.5(C-21)，29.2(C-22)，64.6(C-23)，12.8(C-24)，18.5(C-25)，17.3(C-26)，20.8(C-27)，63.1(C-28)，24.6(C-29)，35.4(C-30)，104.2(C-1′)，77.2(C-2′)，84.6(C-3′)，77.2(C-4′)，70.5(C-5′)，17.2(C-6′)，105.0(C-1″)，74.0(C-2″)，76.4(C-3″)，78.3(C-4″)，77.6(C-5″)，61.3(C-6″)，104.0(C-1′′′)，75.6(C-2′′′)，78.8(C-3′′′)，72.8(C-4′′′)，72.2(C-5′′′)，63.1(C-6′′′)，102.8(C-1′′′′)，72.6(C-2′′′′)，72.1(C-3′′′′)，76.3(C-4′′′′)，70.4(C-5′′′′)，18.7(C-6′′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[3]報道基本一致，故確定化合物1為密蒙花苷C(mimengoside C)。

化合物2 黃色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.03(1H，s，H-2′)，6.94(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.73(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.59(1H，s，H-2)，6.58(1H，s，H-5)，6.45(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，6.27(1H，d，J=15.6 Hz，H-8′)，5.09(1H，s，Rha-H-1′′′)，4.27(1H，d，J=8.4 Hz，Glc-H-1″)，2.66(2H，m，H-7)，1.08(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-H-6′′′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：129.6(C-1)，116.3(C-2)，144.0(C-3)，145.4(C-4)，115.9(C-5)，120.0(C-6)，35.6(C-7)，70.7(C-8)，125.9(C-1′)，115.3(C-2′)，145.1(C-3′)，148.8(C-4′)，116.7(C-5′)，121.9(C-6′)，146.0(C-7′)，114.3(C-8′)，166.9(C=O)，103.0(C-1″)，74.5(C-2″)，81.3(C-3″)，68.9(C-4″)，74.1(C-5″)，63.9(C-6″)，101.0(C-1′′′)，71.0(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.5(C-4′′′)，68.5(C-5′′′)，18.3(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道一致，故鑒定化合物2為異毛蕊花糖苷(isoacteoside)。

化合物3 黃色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.01(1H，s，H-2′)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.75(1H，d，J=7.8 Hz，H-5′)，6.61(1H，s，H-2)，6.48(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，6.18(1H，d，J=16.2 Hz，H-8′)，5.02(1H，s，rha-H-1′′′)，4.35(1H，d，J=7.8 Hz，glc-H-1″)，2.68(2H，m，H-7)，0.94(3H，d，J=6.0 Hz，rha-H-6′′′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：129.6(C-1)，116.2(C-2)，144.0(C-3)，145.4(C-4)，115.9(C-5)，120.0(C-6)，35.4(C-7)，70.7(C-8)，125.9(C-1′)，115.1(C-2′)，146.0(C-3′)，140(C-4′)，116.7(C-5′)，121.9(C-6′)，148.9(C-7′)，114.0(C-8′)，166.1(C=O)，102.7(C-1″)，74.9(C-2″)，79.5(C-3″)，69.6(C-4″)，74.9(C-5″)，61.2(C-6″)，101.7(C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.1(C-4′′′)，69.2(C-5′′′)，18.6(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道一致，故鑒定化合物3為毛蕊花糖苷(acteoside)。

化合物4 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.43(1H，s，H-6)，7.41(1H，s，H-2)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.82(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.63(1H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，3.78(3H，s，H-OCH3)，3.50(2H，t，H-7′)，2.55(2H，t，H-8′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：122.1(C-1)，113.1(C-2)，147.6(C-3)，151.5(C-4)，115.4(C-5)，123.9(C-6)，167.7(C-7)，56.0(3-OCH3)，130.09(C-1′)，129.9(C-2′)，115.4(C-3′)，155.9(C-4′)，115.4(C-5′)，129.9(C-6′)，63.0(C-7′)，39.7(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物4為4′-hydroxyphenyl ethyl vanillate。

化合物5 白色粉末(甲醇);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.59(2H，m，H-2′，6′)，6.83(1H，d，J=8.8 Hz，H-5′)，6.24(1H，brd，J=6.4 Hz，H-3)，5.53(1H，d，J=1.6 Hz，H-1)，5.02(2H，m，H-4，6)，4.68(1H，d，J=8.0 Hz，H-1-glc)，3.90(3H，s，-OCH3)，3.00(1H，brd，J=8.8 Hz，H-5)，2.62(1H，brd，J=14.4 Hz，H-9)，2.29(1H，dd，J=14.0，6.0 Hz，H-7-a)，2.06(1H，dd，J=14.0，3.6 Hz，H-7-b)，1.42(3H，s，H-10)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：93.5(C-1)，141.2(C-3)，104.7(C-4)，39.6(C-5)，80.8(C-6)，47.9(C-7)，79.3(C-8)，51.8(C-9)，26.3(C-10)，125.3(C-1′)，113.8(C-2′)，148.8(C-3′)，153.1(C-4′)，116.0(C-5′)，122.9(C-6′)，168.0(C=O)，56.5(3′-OCH3)，99.5(C-1′′)，74.9(C-2′′)，78.1(C-3′′)，71.8(C-4′′)，78.3(C-5′′)，63.0(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，確定化合物5為6-O-香草酰筋骨草苷(6-O-vanilloylajugol)。

化合物6 白色粉末(甲醇);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.72(2H，s，H-2，6)，6.66(2H，s，H-2′，6′)，4.87(1H，d，J=7.6 Hz，H-1′′)，4.77(1H，d，J=3.6 Hz，H-7)，4.72(1H，d，J=3.6 Hz，H-7′)，4.29(2H，m，H-9β，9′β)，3.92(2H，m，H-9α，9′α)，3.86(6H，s，3′，5′-OCH3)，3.85(6H，s，3，5-OCH3)，3.14(2H，brs，H-8，8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：133.2(C-1)，104.6(C-2，6)，149.4(C-3，5)，136.3(C-4)，87.3(C-7)，55.6(C-8)，72.9(C-9)，135.7(C-1′)，104.9(C-2′，6′)，139.6(C-4′)，154.5(C-3′，5′)，87.7(C-7′)，55.8(C-8′)，73.0(C-9′)，57.2(-OCH3×2，OCH3-3，5)，56.9(-OCH3×2，OCH3-3′，5′)，105.4(C-1′′)，75.8(C-2′′)，77.9(C-3′′)，71.4(C-4′′)，78.4(C-5′′)，62.7(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故確定化合物6為syringaresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物7 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.75(2H，s，H-2，6)，6.54(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，6.33(1H，dt，J=16.2，5.4 Hz，H-8)，4.22(2H，d，J=5.4Hz，H-9)，3.85(6H，s，-OCH3)，4.87(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：130.1(C-1)，105.5(C-2，6)，154.4(C-3，5)，136.0(C-4)，135.3(C-7)，131.4(C-8)，63.7(C-9)，57.1(-OCH3×2，OCH3-3′，5′)，105.4(C-1′)，75.8(C-2′)，78.5(C-3′)，71.4(C-4′)，77.9(C-5′)，62.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[9，10]基本一致，故確定化合物7為刺五加苷B(eleutheroside B)。

化合物8 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.10(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.07(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.95(1H，dd，J=8.4，1.2 Hz，H-6)，6.54(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.28(1H，dt，J=15.6，6.0 Hz，H-8)，4.21(2H，d，J=6.0 Hz，H-9)，3.87(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：133.7(C-1)，111.4(C-2)，151.0(C-3)，147.7(C-4)，118.0(C-5)，120.8(C-6)，131.4(C-7)，129.0(C-8)，63.8(C-9)，56.8(3-OCH3)，102.8(C-1′)，74.9(C-2′)，77.9(C-3′)，71.4(C-4′)，78.3(C-5′)，62.6(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，確定化合物8為松柏苷(coniferin)。

化合物9 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.60(1H，d，J=10.2 Hz，H-11)，6.42(1H，dd，J=10.8，3.0 Hz，H-12);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：39.0(C-1)，26.5(C-2)，84.5(C-3)，41.5(C-4)，50.0(C-5)，19.0(C-6)，32.3(C-7)，41.3(C-8)，55.8(C-9)，37.4(C-10)，127.4(C-11)，126.6(C-12)，135.3(C-13)，43.6(C-14)，33.1(C-15)，78.1(C-16)，44.5(C-17)，135.3(C-18)，33.7(C-19)，30.5(C-20)，30.5(C-21)，29.7(C-22)，63.8(C-23)，12.8(C-24)，17.0(C-25)，17.4(C-26)，20.3(C-27)，63.7(C-28)，24.3(C-29)，26.6(C-30)，103.6(C-1′)，76.4(C-2′)，85.7(C-3′)，72.5(C-4′)，71.3(C-5′)，21.0(C-6′)，104.9(C-1″)，76.1(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.3(C-5″)，62.5(C-6″)，105.5(C-1′′′)，75.4(C-2′′′)，78.4(C-3′′′)，72.8(C-4′′′)，74.1(C-5′′′)，63.1(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故確定化合物9為醉魚草皂苷Ⅳb(buddlejasaponin Ⅳb)。

化合物10 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.00(1H，s，H-4′′′)，7.56(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)，7.53(2H，d，J=8.4Hz，H-2′′′，6′′′)，6.78(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′′′，C-5′′′)，6.41(1H，dd，J=6.0，1.2Hz，H-3)，6.38(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，5.25(1H，d，J=4.8Hz，H-1)，5.10(1H，d，J=4.2 Hz，H-1′′)，5.05(1H，d，J=6.6 Hz，H-4)，4.58(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，1.17(3H，d，J=6.0 Hz，H-6′′);13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：93.1(C-1)，141.0(C-3)，102.4(C-4)，35.6(C-5)，81.7(C-6)，57.5(C-7)，65.4(C-8)，41.9(C-9)，58.8(C-10)，97.9(C-1′)，74.0(C-2′)，77.5(C-3′)，70.3(C-4′)，76.4(C-5′)，61.4(C-6′)，98.8(C-1′′)，68.2(C-2′′)，73.5(C-3′′)，69.1(C-4′′)，68.9(C-5′′)，17.9(C-6′′)，125.2(C-1′′′)，130.3(C-2′′′)，115.9(C-3′′′)，159.8(C-4′′′)，115.9(C-5′′′)，130.3(C-6′′′)，114.2(C-α)，144.6(C-β)，166.4(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故確定化合物10為6-O-(3″-O-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranosyl)catalpol。

4 化合物活性的篩選

將SH-SY5Y細胞在37 ℃、5% CO2及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)與DMEM培養(yǎng)基(另加胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶)，待細胞增殖至約80%時鋪板，培養(yǎng)細胞按每孔100 μL的密度種植于96孔培養(yǎng)板中。細胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，將各個樣品配制成4個濃度梯度(31、62、125、250 μmol/L)加到96孔培養(yǎng)板中，每個濃度梯度設6個復孔，并設置空白孔(等體積PBS)、正常孔(不含血清的完全培養(yǎng)基)、模型孔(不含血清的完全培養(yǎng)基加入1 mmol/L的MPP+)，作用1 h后加入1 mmol/L MPP+，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于每孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內(nèi)的培養(yǎng)液，在每孔加入150 μL的DMSO，低速振蕩10 min，酶標儀570 nm波長下測定其吸光度(A)值，并計算細胞存活率。

注：與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the model group:*P<0.05,**P<0.01.

通過MTT法對部分化合物給藥的細胞存活率進行測定，與模型組相比較(見表1)，所選的4個化合物對MPP+損傷的SH-SY5Y細胞均具有一定的保護作用。其中化合物1和5給藥的細胞存活率隨著給藥濃度的增大而增大；化合物6和7給藥的細胞存活率先隨著給藥濃度的增高而增大，藥物濃度達到一定濃度后，細胞存活率達到最大，進一步增大給藥濃度，細胞存活率會有所下降。

5 結(jié)論

本研究從醉魚草果實水部位分離純化得到密蒙花苷C(1)、異毛蕊花糖苷(2)、毛蕊花糖苷(3)、4′-hydroxyphenyl ethyl vanillate(4)、6-O-香草酰筋骨草苷(5)、syringaresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside(6)、刺五加苷B(7)、松柏苷(8)、醉魚草皂苷Ⅳb(9)、6-O-(3"-O-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranosyl)catalpol(10)等10個化合物，其中化合物4、6、7、8和10為首次從醉魚草屬植物中分離得到，化合物2和3為首次從醉魚草果實中分離得到；利用MPP+誘導的SH-SY5Y細胞模型對化合物1、5、6和7的神經(jīng)保護作用進行考察，結(jié)果顯示四個化合物均能使細胞存活率顯著提高。本研究進一步豐富了醉魚草果實中化學成分類型，為更好的開發(fā)利用醉魚草資源提供參考。