美滿霉素對阿爾茨海默病大鼠認(rèn)知功能和前額葉皮層GLT-1表達(dá)的影響

孫縵利 鄧海峰 王興紅 常全忠

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462000)

阿爾茨海默病(AD)是一種多發(fā)于老年人的神經(jīng)退行性疾病，漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙是其最典型的臨床癥狀〔1〕。AD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，目前尚未闡明清楚〔2〕。目前，越來越多的證據(jù)提示突觸間隙中谷氨酸(Glu)含量的變化和AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系〔3〕，而突觸間隙中絕大多數(shù)的Glu是通過神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上分布的谷氨酸轉(zhuǎn)運體(GLT)-1攝取和轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜內(nèi)，從而達(dá)到清除突觸間隙內(nèi)多余的Glu的目的〔4〕。實驗研究顯示，在AD發(fā)病早期，腦內(nèi)即出現(xiàn)GLT-1表達(dá)減少，而上調(diào)GLT-1的表達(dá)可以明顯改善AD認(rèn)知障礙的癥狀〔5，6〕。

美滿霉素(minocycline)是一種四環(huán)素類抗生素，除了具有消炎抑菌作用外，還可以通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活等途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用〔7，8〕，是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑。但美滿霉素的神經(jīng)保護(hù)作用是否和GLT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)，目前仍不清楚。本研究通過觀察美滿霉素對AD大鼠前額葉皮層GLT-1表達(dá)的影響，初步探討美滿霉素對AD大鼠的腦保護(hù)機(jī)制，為美滿霉素防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 DW-5大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；Morris水迷宮裝置(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)；美滿霉素膠囊(中國惠氏制藥有限公司)；Glu標(biāo)準(zhǔn)品(上海銘博生物科技有限公司)；兔抗鼠GLT-1多克隆抗體(Abcam公司)；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG均購自碧云天生物技術(shù)公司；β淀粉樣蛋白(Aβ)25～35和戊巴比妥鈉購自Sigma公司。

1.2動物分組及給藥 SD大鼠48只，雄性，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號為SCXK(湘)2011-0003，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開始實驗。所有動物都在自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由覓食、飲水。實驗動物隨機(jī)分為對照組、模型組和美滿霉素治療組，每組16只。對照組側(cè)腦室注射生理鹽水5 μl，術(shù)后腹腔注射生理鹽水10 ml/kg；模型組側(cè)腦室注射Aβ25～355 μl，術(shù)后腹腔注射同對照組；美滿霉素治療組側(cè)腦室注射Aβ25～355 μl，術(shù)后腹腔注射美滿霉素50 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥2 w。

1.3AD模型制備 大鼠經(jīng)0.8%戊巴比妥鈉(0.1 ml/10 g)麻醉后，固定于腦立體定位儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點，定位側(cè)腦室位置(AP：-1.5 mm，ML：0.8 mm，DV：3.5 mm)，將凝聚態(tài)Aβ25～35在5 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min。模型組和美滿霉素治療組均給予5 μl Aβ25～35，對照組給予等量生理鹽水。

1.4Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮水溫(23±3)℃，實驗的1～4 d記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所用的時間，即為逃避潛伏期，大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立30 s。若入水后120 s大鼠未能找到平臺，則將其輕輕從水中拖上平臺，并停留30 s，潛伏期記為120 s。實驗第5天去除平臺，將大鼠從入水點放入水中，測其第一次到達(dá)原平臺位置所用的時間、120 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)(穿環(huán)次數(shù))。

1.5高效液相色譜法檢測大鼠前額葉皮層Glu含量 水迷宮實驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只大鼠斷頭取腦，冰浴分離前額葉皮層，稱重，加入0.4 mol/L高氯酸溶液，充分勻漿15 min，靜置30 min，低溫離心(10 000 r/min，15 min)吸取上清液，加入4%碳酸氫鈉溶液(碳酸氫鈉溶液與上清液的比例為0.75 ml∶1 ml)，低溫離心(3 000 r/min，15 min)，提取上清液，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采?，4-二硝基氯苯柱前衍生化高效液相色譜法檢測各組大鼠前額葉皮層中Glu的含量情況。

1.6免疫熒光組化檢測前額葉皮層GLT-1的表達(dá) 大鼠經(jīng)心臟灌流固定，用徠卡冰凍切片機(jī)對灌流固定好的腦組織行冠狀切片，厚度為30 μm。0.3% Triton X-100破膜處理2 h，10%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，加入一抗(GLT-1，1∶500)，置于4℃冰箱過夜，加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育2 h，90%甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，利用Image Pro Plus6.0 圖像分析軟件測定積分光密度值(IOD)。

1.7Western印跡法檢測大鼠前額葉皮層GLT-1表達(dá) 大鼠斷頭取腦，冰浴分離前額葉皮層，稱重，按10 ml/g的比例加入全細(xì)胞裂解液，組織經(jīng)勻漿、超聲破碎后，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)硝酸纖維素(NC)膜。雜交步驟如下：10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，1×TBST漂洗3次，每次5 min，與兔多克隆抗體GLT-1(1∶1 000)雜交反應(yīng)2 h，再將NC膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG(1∶3 000)雜交反應(yīng)1 h。加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑反應(yīng)5 min，暗室進(jìn)行X線膠片曝光、顯影和定影。然后同一張NC膜再與β-actin(1∶1 000)進(jìn)行雜交反應(yīng)。Western印跡條帶經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理，計算單位光密度值和條帶面積。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1水迷宮實驗結(jié)果 與對照組相比，模型組逃避潛伏期明顯長于對照組，第一次到達(dá)原平臺用的時間明顯延長，120 s內(nèi)的穿環(huán)次數(shù)明顯減少(均P<0.05)；與模型組相比，美滿霉素治療組逃避潛伏期明顯縮短，第一次到達(dá)原平臺用的時間明顯縮短，120 s內(nèi)的穿環(huán)次數(shù)明顯增加(均P<0.05)，見表1。

表1 各組行為學(xué)指標(biāo)比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2高效液相色譜法實驗結(jié)果 與對照組〔(7.52±1.02)μmol/mg〕相比，模型組前額葉皮層Glu含量明顯增多〔(20.27±2.36)μmol/mg,P<0.05〕；美滿霉素治療組較模型組明顯減少〔(12.56±1.53)μmol/mg,P<0.05〕，但仍高于對照組(P<0.05)。

2.3免疫熒光組化結(jié)果 與對照組(0.86±0.07)比較，模型組前額葉皮層GLT-1表達(dá)明顯減少(0.39±0.04，P<0.05)；與模型組比較，美滿霉素治療組GLT-1表達(dá)明顯增多(0.62±0.05，P<0.05)，但仍低于對照組(P<0.05)。見圖1。

2.4Western印跡結(jié)果 與對照組(1.15±0.08)比較，模型組前額葉皮層GLT-1表達(dá)明顯減少(0.46±0.05，P<0.05)；與模型組比較，美滿霉素治療組GLT-1表達(dá)明顯增多(0.90±0.07，P<0.05)，見圖2。

圖1 各組前額葉皮層GLT-1的表達(dá)(×200，bar=50 μm)

圖2 各組前額葉皮層GLT-1的表達(dá)

3 討 論

美滿霉素是一種安全性較高的第二代四環(huán)素衍生物，容易透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，被證實在腦缺血、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物實驗中具有積極的作用〔8，9〕，但是關(guān)于美滿霉素對AD是否有效目前鮮少報道。本研究表明美滿霉素可以改善AD大鼠的認(rèn)知功能障礙。

Glu是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種重要的興奮性氨基酸，由谷氨酸能神經(jīng)元釋放到突觸間隙，通過位于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上的GLT-1及時轉(zhuǎn)運清除〔4〕。各種原因造成的GLT功能障礙或Glu釋放增加，都會導(dǎo)致突觸間隙內(nèi)的Glu堆積，進(jìn)而造成興奮性神經(jīng)毒性作用，嚴(yán)重時導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)功能受損，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。來自AD患者〔5〕及AD動物模型〔6〕的實驗研究顯示，在AD發(fā)病早期腦內(nèi)即出現(xiàn)GLT-1表達(dá)減少，而上調(diào)GLT-1表達(dá)可以明顯改善AD認(rèn)知障礙癥狀。Meeker等〔10〕報道GLT-1缺失可以導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)insulin/Akt信號通路異常，而后者是引發(fā)AD的一個重要因素。以上結(jié)果提示GLT-1功能和AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但美滿霉素對AD大鼠認(rèn)知功能的影響是否和GLT-1的功能有關(guān)，目前還不清楚。

本課題組通過檢測各組大鼠前額葉皮層Glu的含量及GLT-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AD大鼠前額葉皮層Glu含量明顯增加，GLT-1表達(dá)明顯降低；美滿霉素可以上調(diào)GLT-1的表達(dá)，降低前額葉皮層中Glu含量。

綜上所述，本研究結(jié)果初步表明美滿霉素可以改善AD大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與上調(diào)前額葉皮層GLT-1的表達(dá)、降低突觸間隙內(nèi)Glu的含量有關(guān)。