青蒿琥酯對人結(jié)腸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響

田芝瑜 李燕嬌 劉濟豪 羅強 孫黎 劉芳 張林西 郭穎

(河北北方學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口 075000；2生命科學(xué)研究中心)

青蒿琥酯(ART)是青蒿素的衍生物。由于青蒿素及其衍生物起效快、毒性低、療效確切，已成為臨床治療瘧疾的一線藥物〔1,2〕。除了抗瘧作用外，不少研究者發(fā)現(xiàn)ART還具有抗腫瘤活性，但關(guān)于其對結(jié)腸癌的作用尚未明確〔3,4〕。本文通過檢測β-連環(huán)蛋白(catenin)、T細(xì)胞因子(TCF)-4、c-Myc蛋白的表達(dá)，探索ART對人結(jié)腸癌(CRC)細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 CRC細(xì)胞LoVo由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院提供。

1.1.2藥品與試劑 ART購自桂林南藥股份有限公司(批號H10930195)，F(xiàn)12K培養(yǎng)基購自Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物制品有限公司，蛋白提取試劑盒及蛋白定量試劑盒及(CCK-8)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司，β-catenin(E-5)、β-actin(9)、c-Myc(9E10)單克隆抗體及TCF-4(H-125)多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，免疫組化檢測試劑盒Polink-2 plus購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇LoVo細(xì)胞，加入含有F12K和10% FBS的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合，經(jīng)胰酶消化后，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2CCK-8法檢測不同時間、不同濃度ART作用于LoVo細(xì)胞的抑制率 在細(xì)胞對數(shù)生長期，將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜后，加藥，分為24 h(A)、48 h(B)、72 h(C)3組，每組設(shè)同樣的8個濃度，每個濃度設(shè)2個復(fù)孔，不加ART僅添加完全培養(yǎng)基的為對照組，將1 mol/L的ART與培養(yǎng)基配成終濃度為3.75、7.50、15.00、30.00、60.00、90.00、120.00 μmol/L，置37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后，A組加入CCK-8試劑，培養(yǎng)1.5 h，酶標(biāo)儀檢測吸光度值(A1)，計算抑制率。同樣條件培養(yǎng)48 h和72 h，同樣方法測B組吸光度值(A2)、C組吸光度值(A3)。再根據(jù)公式：抑制率=1-(實驗組OD值/對照組OD值×100%)，求出每組的抑制率。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法測定ART處理細(xì)胞后β-catenin、c-Myc、TCF-4蛋白的表達(dá) 將對數(shù)生長期的細(xì)胞分配到2個6孔板中，先設(shè)立3個不加藥的對照組，再加入終濃度分別為7.5、30.0、60.0 μmol/L的ART，各3個孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中作用48 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，10%甲醇固定15 min，PBS沖洗3次，每次5 min，3%H2O2室溫孵育15 min，向各組分別滴入β-catenin、TCF-4、c-Myc一抗，56℃水浴孵育2 h，PBS沖洗3次，每次2 min；每孔均滴入試劑一2～3滴，在37℃水浴孵育20 min，PBS洗3次，每次2 min，每孔均滴入試劑二2～3滴，在37℃水浴中孵育20 min，現(xiàn)配DAB顯色試劑，在鏡下邊滴加邊觀察，直至視野中出現(xiàn)陽性染色，蒸餾水終止，沖洗染色，蘇木素染色1～2 s，蒸餾水終止，鹽酸酒精5～6 s，蒸餾水終止，梯度酒精脫水，二甲苯透明1～2 min，中性樹膠封片，觀察。

1.2.4Western印跡法檢測β-catenin、c-Myc、TCF-4蛋白表達(dá)的變化 將8瓶處在對數(shù)生長期的細(xì)胞分別加入終濃度分別為7.5、30.0、60.0 μmol/L的ART各2瓶，并設(shè)立2瓶不加藥對照組，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中作用48 h后，用細(xì)胞刮收集上述所有細(xì)胞，離心，預(yù)冷PBS吹打，重復(fù)2次，裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)按10∶1比例混合，裂解液吹打，移入EP管，放于冰上，低溫離心吸出上清即為細(xì)胞總蛋白。將提出的總蛋白定量后將蛋白樣品分為對照組、7.5、30.0、60.0 μmol/L。BCA測定試劑盒檢測蛋白濃度，按每泳道40 μg上樣，電泳后半干電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，一抗、二抗孵育后電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，觀察各條帶顯色情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-Q檢驗法。

2 結(jié) 果

2.1CCK-8法檢測結(jié)果 24、48、72 h分別檢測到在0～120 μmol/L，隨ART濃度升高，LoVo細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度ART對LOVO細(xì)胞增殖的抑制作用

與3.75 μmol/L組比較：1)P<0.05；與7.50 μmol/L組比較：2)P<0.05；與15.00 μmol/L組比較：3)P<0.05；與30.00 μmol/L組比較：4)P<0.05；與60 μmol/L組比較：5)P<0.05

2.2免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測ART對β-catenin、c-Myc、TCF-4表達(dá)的影響 7.5、30.0、60.0 μmol/L ART處理LoVo細(xì)胞48 h之后，可見細(xì)胞質(zhì)濃縮，并且隨藥物濃度增加，細(xì)胞形態(tài)越圓，部分細(xì)胞甚至不貼壁而死亡。結(jié)果顯示，對照組中的β-catenin、c-Myc、TCF-4均呈強陽性表達(dá)，c-Myc、TCF-4為胞質(zhì)陽性，β-catenin為胞膜陽性。見圖1～3。

2.3Western印跡檢測ART對β-catenin、c-Myc、TCF-4表達(dá)的影響 免疫印跡結(jié)果表明：以β-actin 為內(nèi)參，經(jīng)7.5、30.0、60.0 μmol/L ART處理LoVo細(xì)胞48 h后，β-catenin、c-Myc和TCF-4蛋白水平明顯低于對照組，并隨ART濃度升高，表達(dá)呈下降趨勢。見圖4。

圖1 β-catenin蛋白表達(dá)(DAB染色；×400)

圖2 c-Myc蛋白表達(dá)(DAB染色；×400)

圖3 TCF-4蛋白表達(dá)(DAB染色；×400)

圖4 ART對結(jié)腸癌細(xì)胞β-catenin、c-Myc、TCF-4表達(dá)影響

3 討 論

近年來我國結(jié)腸癌發(fā)病率逐年遞增，其發(fā)病機制尚不完全清楚，雖然手術(shù)切除仍然為該疾病的治療方法，但術(shù)后存在的高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率和5年低生存率不容忽視，盡快找到新的治療方法尤為重要。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長，且毒副作用小，在抗腫瘤方面有著良好的應(yīng)用前景〔5，6〕。ART是青蒿素的衍生物之一，也呈現(xiàn)出抗多種癌細(xì)胞活性的作用〔7,8〕。本課題組用不同濃度ART處理體外培養(yǎng)的LoVo細(xì)胞，取得較大的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)ART能夠抑制LoVo細(xì)胞的增殖。

Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用，在腫瘤發(fā)生過程中也一直被認(rèn)為是一個關(guān)鍵的信號通路〔9〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵分子。正常體細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)存在的β-catenin會被一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)磷酸化，磷酸化后，β-catenin由針對蛋白水解的蛋白酶體降解〔10〕，從而抑制了Wnt信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)β-catenin不被這種復(fù)雜蛋白質(zhì)降解時，就會在胞質(zhì)內(nèi)積累，一旦有機會被TCF-4轉(zhuǎn)錄因子攜帶入核，就會啟動下游靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有研究認(rèn)為，通過抑制Wnt信號通路治療結(jié)腸癌時，β-catenin可以作為一個潛在的基因〔11〕。TCF屬于一種細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控下游基因的表達(dá)。TCF家族包括TCF-1，TCF-2，TCF-3等，其中 TCF-4 在哺乳類上皮中表達(dá)，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，參與上皮細(xì)胞的發(fā)育和分化，與腫瘤的形成密切相關(guān)〔12〕。在缺乏信號刺激時，轉(zhuǎn)錄抑制因子與細(xì)胞核內(nèi)的TCF-4結(jié)合，封閉下游基因的轉(zhuǎn)錄；但是當(dāng)Wnt信號激活時，上游信號分子β-catenin進(jìn)入核內(nèi)，競爭性結(jié)合核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF-4，去除了信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制作用，啟動了下游靶基因如cyclin-D1、CD44、c-Myc等的表達(dá)，刺激結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展。其中，c-Myc具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，并具有與染色體DNA結(jié)合的特性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用〔13〕。當(dāng)β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)聚集，使下游的靶基因c-Myc高表達(dá)，促使結(jié)腸癌形成。李琳娜等〔14〕實驗結(jié)果表明，經(jīng)ART作用后，結(jié)腸癌細(xì)胞的β-catenin從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，其轉(zhuǎn)錄活性也明顯降低，靶基因c-Myc的表達(dá)量均顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌發(fā)生過程中β-catenin、c-Myc和TCF-4蛋白表達(dá)增強，而應(yīng)用ART處理后表達(dá)均減弱，說明ART可通過降低Wnt/β-catenin信號通路中的β-catenin、c-Myc和TCF-4蛋白的表達(dá)抑制LoVo細(xì)胞的增殖。

通過以上研究，為ART的抗腫瘤作用提供了一個初步的有力依據(jù)，在結(jié)腸癌的治療方面具有重要的理論和實用價值。相信隨著人們對Wnt/β-catenin信號通路中各因子的深入研究，會進(jìn)一步明確Wnt/β-catenin信號通路與結(jié)腸癌之間的關(guān)系，為結(jié)腸癌的治療開拓新的領(lǐng)域。