高產酸醋酸菌的選育和耐酸機制研究進展

王麗婷，郭會明，洪厚勝

(1.南京工業(yè)大學 化學與分子工程學院，南京 211816；2.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院，南京 211816)

醋酸菌是一大類革蘭氏陰性、嚴格需氧菌，主要棲息于含糖、酸或乙醇的原料中[1]。從1989年醋酸桿菌屬(Acetobacter)被Beijerinck提出到目前為止，一共發(fā)現了19個醋酸菌屬，其中Acetobacter，Gluconobacter，Gluconacetobacter，Asaia，Komagataeibacter5個屬中均含有大量不同的菌種[2,3]。醋酸菌綱的微生物是嚴格需氧的，氧在呼吸代謝中是電子的最終受體，醋酸菌中除Asaia外，都能通過呼吸作用氧化乙醇，最終產生醋酸[4]。對醋酸菌進行分離、培養(yǎng)、保存、鑒定，篩選出高產酸的醋酸菌菌種，對生產高酸度醋具有重要的指導作用。

高酸度醋是指總酸含量為9%～25%(質量分數)的釀造醋，具有殺菌效果好、保鮮時間長、成本較低等優(yōu)勢[5]。采用液態(tài)深層發(fā)酵法直接轉化食用酒精為醋酸是生產高酸度醋的重要方法[6]。我國高酸度醋的生產水平與世界先進水平相比仍有較大差距，而生產高酸度醋的關鍵是要掌握菌種、工藝、設備等方面的先進技術[7]。本文主要對高產酸菌種的選育和醋酸菌的耐酸機制進行了綜述，為高酸度醋生產菌種的選育提供了研究思路。

1 高產酸菌種的篩選方法

1.1 自然選育

傳統(tǒng)的篩選優(yōu)良菌種的方法是采集發(fā)酵中的醋醅，進行梯度稀釋得到不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)液，在含有碳酸鈣的分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可以在平板上產生透明圈的菌株，即為產酸的醋酸菌，然后進行初篩，對那些形態(tài)優(yōu)良、H/C(透明圈直徑與菌落直徑的比值)值較大的單菌落劃線純化培養(yǎng)，并斜面保藏，對初篩的菌種進行產醋酸定性試驗及產酸量測定，對高產酸的菌株劃線純化培養(yǎng)后并保藏[8]。

陳洋等從工業(yè)醋醅中分離篩選出5株耐乙醇、耐高溫的醋酸菌菌株，通過發(fā)酵性能測定，發(fā)現其中FY4的耐受性最強，進行發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)現在相同條件下FY4發(fā)酵特性始終優(yōu)于工業(yè)菌株AS1.41，在37 ℃、10%乙醇的條件下，工業(yè)菌株AS1.41幾乎停止產酸，而FY4仍有較高的產酸量[9]。

用這種傳統(tǒng)的自然選育方法，使醋醅中的混合菌分離開，篩選出性狀優(yōu)良的高產酸菌株，這種方法簡便易行，但是醋醅中的醋酸菌自然突變率很低，往往篩選得到的菌種的性狀遠不及食醋釀造工業(yè)上常用的純種AS1.41和滬釀1.01。

1.2 誘變育種

誘變育種是使用化學方法或物理方法對菌株進行誘變，目的是定向篩選出所需優(yōu)良性狀的菌株。

賀小賢等對保藏的某菌株先進行微波誘變篩選出較高產酸的菌株，再用化學試劑鹽酸羥胺進行誘變，最終篩選出的突變株的產酸量提高了43.55%[10]。彭桂蘭等將通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法得到的2種醋酸菌的菌懸液，放在波長為253.7 nm、15 W的紫外光下照射一定的時間，紫外誘變后得到的2種醋酸菌的產酸率都得到了提高[11]。吳曉英利用室溫等離子體誘變技術選育了1株乙醇耐受性菌株，該菌株的醋酸產量比原始菌株提高了近4倍，同時發(fā)現該誘變菌株與原始菌株相比，細胞膜通透性變小，海藻糖合成量變大[12]。

誘變育種選育醋酸菌操作簡單，突變頻率高，有利于篩選新的優(yōu)良菌種，但是有益突變頻率較低，變異的方向和性質難以控制。

1.3 基因工程技術

王靖等發(fā)現巴氏醋桿菌AC2005的核酸修復酶uvrA的轉錄水平會隨著菌體所處醋酸濃度的增大而增加，于是構建了uvrA基因敲除菌株和uvrA重組表達菌株，將菌株放置于一定的醋酸濃度下培養(yǎng)，比較它們的生長情況，uvrA重組表達菌株的生長量遠高于原始菌株和uvrA基因敲除菌株，即使在較高酸度下，uvrA重組表達菌株的存活率也高于uvrA基因敲除菌株，在相同的發(fā)酵培養(yǎng)基中，uvrA重組表達菌株的產酸量比原始菌株高，而uvrA基因敲除菌株的產酸量比原始菌株低[13]，說明uvrA基因表達量的提高有利于醋酸菌的生長和產酸量的提高。脫氧核糖核酸(DNA)是細胞中重要的物質，當細胞處于高酸高溫等不利條件下時，DNA會損傷，核酸修復酶可以使DNA恢復結構的完整性，所以uvrA的過表達可能有利于醋酸菌在高酸度環(huán)境下進行正常的生理代謝活動。

宋山等通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增乙醇脫氫酶基因片段，構建了乙醇脫氫酶過表達的基因工程菌株，該菌株的乙醇耐受性和平均產酸速率都優(yōu)于原始菌株[14]。乙醇脫氫酶是醋酸菌細胞膜上氧化乙醇生產醋酸的關鍵酶[15]，該酶的過量表達會提高乙醇的轉化率，防止胞外的乙醇流入胞內使醋酸菌死亡。

徐澤明將編碼磷酸組氨醇氨基轉移酶的hisl基因成功導入巴氏醋桿菌中，構建了耐乙醇的基因工程菌株T1，該菌株在9%乙醇濃度的條件下發(fā)酵產酸，產酸量幾乎達到原始菌株的3倍[16]，將hisl基因過表達的菌株與親本菌株進行發(fā)酵性能比較，發(fā)現乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的酶活均會影響到產酸量，酶活越高，產酸量越大，且在乙醇脅迫下醋酸菌的糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)途徑會受到抑制，與碳代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝相關的小分子代謝物含量會發(fā)生變化。

2 醋酸菌的耐酸機制

2.1 細胞膜的保護機制

Acetobacter和Komagataeibacter都是工業(yè)上常用的直接氧化乙醇產醋酸的醋酸菌屬，但是Komagataeibacter的最高產酸量比Acetobacter要高。Goto等通過比較細胞膜磷脂的化學組分發(fā)現，Komagataeibacter的磷脂酰膽堿含量明顯高于Acetobacter[17]。在Komagataeibacter的菌種發(fā)酵產酸過程中，Higashide等發(fā)現隨著醋酸濃度的增加，細胞膜脂質中磷脂酰膽堿的比例增加，磷脂酰甘油的比例減少[18]。Hanada等發(fā)現磷脂酰乙醇胺氮甲基轉移酶(phosphatidylethanolamine N-methytransferase，PMT)基因可以使磷脂酰乙醇胺轉化為磷脂酰膽堿，與正常表達pmt基因的菌株相比，pmt基因中斷突變株無法在細胞膜中產生磷脂酰膽堿，突變株的菌體生長速率變小，最大菌體密度下降[19]。因此，細胞膜中的磷脂酰膽堿含量被認為與醋酸菌的耐酸性有關。

亓正良通過酸激復合紫外誘變篩選得到1株高產酸高耐酸的突變菌株A.pasteurianusCICIM B7003-02，該突變株在醋酸發(fā)酵過程中，細胞莢膜的分泌減少，細胞膜中不飽和脂肪酸的比例增加，細胞膜的流動性增加[20]。因此，細胞膜的結構和組成會影響醋酸菌的耐酸性。

2.2 醋酸同化機制

Fukaya通過對突變株A.pasteurianus進行研究，發(fā)現aarA和aarC是醋酸耐受性基因，與三羧酸循環(huán)中的酶的編碼有關，aarA編碼檸檬酸合成酶[21]；aarC編碼琥珀酰輔酶A轉移酶和乙酰輔酶A轉移酶，使琥珀酰輔酶A轉化為琥珀酸，使胞內醋酸轉化為乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)[22]。Nakano發(fā)現順烏頭酸酶過表達菌株的產酸量與耐酸性都優(yōu)于原始菌株[23]，順烏頭酸酶是在三羧酸循環(huán)中轉化檸檬酸為異檸檬酸的酶。三羧酸循環(huán)偶聯有氧呼吸產能途徑——巴氏醋酸桿菌TCA循環(huán)其琥珀酰輔酶A到琥珀酸和蘋果酸到草酰乙酸的代謝通路的酶不存在，要通過其他氨基酸回補途徑運行并釋放能量。胞內醋酸可以通過三羧酸循環(huán)途徑被消耗，構建胞內完整且高效的三羧酸循環(huán)通路，會提高醋酸菌的耐酸性能。

2.3 醋酸泵出機制

AatA是細胞膜上的ATP結合盒(ABC)轉運體蛋白，可以將細胞內的醋酸泵出[24]。Nakano等發(fā)現AatA基因中斷菌株在較高醋酸濃度的環(huán)境中，菌體生長速率下降，對醋酸的耐受性降低。進一步研究發(fā)現，攜帶AatA的大腸桿菌轉基因菌株對醋酸的耐受性得到了提高[25]。因此，AatA基因與醋酸菌的耐受性有關。

Matsushita發(fā)現醋酸菌A.pasteurianus胞內的醋酸濃度在呼吸底物存在的情況下較低，添加呼吸作用解偶聯劑后，胞內醋酸濃度增加，外側的膜囊泡通過呼吸作用產生的能量將被動運輸進入胞內的醋酸泵出細胞外，內側的膜囊泡通過呼吸作用積累醋酸，最終發(fā)現醋酸菌A.pasteurianus細胞膜上存在依靠質子動能勢的醋酸外排泵[26]。

2.4 細胞對環(huán)境變化的適應機制

Okamoto-Kainuma發(fā)現當醋酸菌處在含有乙醇、醋酸、高溫的環(huán)境中時，細胞內會產生多種分子伴侶蛋白[27]。其中，GroES和GroEL含有熱休克啟動子同源序列，這2種蛋白質的表達受到RpoH基因的控制，實驗表明，RpoH基因中斷突變菌株對乙醇、醋酸、溫度變化的耐受性比原始菌株差，而過量表達GroES的菌株的產酸量比原始菌株高[28]。

醋酸菌在細胞膜內側的酶的催化作用下，將乙醇氧化為乙醛再氧化為醋酸。乙醇脫氫酶(ADH)將乙醇氧化為乙醛，乙醛脫氫酶(ALDH)將乙醛氧化為醋酸，電子從乙醇和乙醛轉移到輔酶Q，生成泛素醇[29,30]，最終泛素醇氧化酶將電子從泛素醇轉移到氧中生成水[31]。當不能反應完全時，會產生活性氧(ROS)，如超氧陰離子和過氧化氫，Okamoto-Kainuma發(fā)現，在含有乙醇和醋酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)醋酸菌，過氧化氫酶調節(jié)因子突變株不能調節(jié)胞內過氧化氫濃度，其生長速率比原始菌株慢[32]。這些現象表明醋酸菌細胞內活性氧的快速降解有利于實現穩(wěn)定高效的醋酸發(fā)酵。

3 結論與展望

高產酸醋酸菌的選育方法包括自然育種、誘變育種和基因工程技術。選育出高產酸的菌種，提高菌體的比生長速率，可以使單位時間內的產酸量提高，對高酸度液態(tài)醋的工業(yè)生產具有重要的指導意義。其中，通過基因工程技術改良菌種的方法更具有針對性，應該作為高產酸菌種選育的研究重點。

醋酸菌的耐酸機制十分復雜，目前對醋酸菌耐酸機制的認識并不透徹。已發(fā)現的醋酸菌耐酸機制，包括細胞膜的保護機制、醋酸同化機制、醋酸泵出機制、細胞對環(huán)境變化的適應機制4個方面。尋找這些機制的聯系和紐帶，研究這些機制之間的協(xié)作關系，探索新的耐酸機制，對全面地闡明醋酸菌的耐酸機制具有重要的意義，有利于指導高產酸菌種的選育，為高酸度醋生產的菌種選育方面提供了幫助。