禽源布利丹沙門菌的鑒定及耐藥性分析

朱天倫，陳 革，繆衛(wèi)媛，高 尚，楊躍飛，王彥紅

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009 ； 2. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009)

沙門菌是革蘭染色陰性，具有廣泛宿主的一種腸道桿菌，可引起多種動物沙門菌病及人類食物中毒和感染性腹瀉。其中布利丹沙門菌是一種可引起人類感染的致病菌，在北京、廣州等多地引起過多次人類食物中毒，2005年在山東還曾有引起兒童化膿性腦膜炎的報道[1-3]。從禽類病料中分離出布利丹沙門菌的報道較少，為進一步做好疾病防治工作，了解布利丹沙門菌對禽類養(yǎng)殖及人類食品安全的影響，本試驗對臨床采集到的布利丹沙門菌進行分離鑒定，對其藥敏反應及生化特點進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料來源 本試驗分離得到的3株細菌均來自于2017年7月-10月間揚州大學動物醫(yī)院收到的送檢病死雞，分別編號J1～J3。J1是江蘇揚州寶應的5月齡雞，飼養(yǎng)100只，死亡率較高，病雞剖檢發(fā)現(xiàn)喉部充血，腸道有較多蛔蟲和大量的絳蟲。J2為江蘇揚州1年齡以上的草雞，飼養(yǎng)10只，死亡2只，送檢1只，病程7 d左右。J3為江蘇邵伯真武的草雞，145日齡，飼養(yǎng)400～500只，就診后用磺胺藥，剖檢發(fā)現(xiàn)腸道有很多大小不一的線蟲，肝臟有大小不一的白色壞死灶，膽囊充盈，腸道內容物鏡檢發(fā)現(xiàn)球蟲。

1.2 主要試劑 用市售的普通綿羊血和普通營養(yǎng)瓊脂粉按常規(guī)方法配制成血瓊脂平板，按常規(guī)方法配制的麥康凱瓊脂平板；生化培養(yǎng)管和藥敏試紙,購自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清,購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng) 挑選病死雞的肝臟按常規(guī)無菌操作接種于血瓊脂平板上，放置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，挑選疑似單菌落分別在綿羊血培養(yǎng)基與麥康凱培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。觀察純化菌的生長狀況和形態(tài)特征。

1.4invA鑒定 利用PCR擴增invA基因能特異性檢測沙門菌[4]。根據(jù)文獻方法合成特異性引物[5]，將分離株采用煮沸裂解法制備出細菌基因組DNA模板，并將其進行PCR擴增，PCR體系為25 μL，分別是：2.5 μL 10×Buffer、0.5 μL dNTP、0.2 μL上游和下游引物、0.25 μLTaq聚合酶、19.55 μL 超純水、2 μL模板DNA。取PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.5 生化試驗 用接種針挑取純化后的細菌單個菌落，分別接種于乳糖、木糖、枸櫞酸鹽、衛(wèi)茅醇、蔗糖、尿素、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鳥氨酸、麥芽糖、賴氨酸、甘露醇、靛基質、硝酸鹽還原、V-P試驗、M.R.試驗氨基酸對照生化管內反應，置37 ℃條件培養(yǎng)48 h，按生化反應管說明書進行判斷。

1.6 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer藥敏紙片的方法，采用頭孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、妥布霉素、阿莫西林、頭孢噻肟、舒巴坦這18種藥敏紙片，在無菌條件下，挑取經過純化的菌株，涂布均勻于麥康凱培養(yǎng)基上，取藥敏紙片貼于平板瓊脂面上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h觀察結果，測量出各抗生素紙片的抑菌圈直徑。藥敏試驗抑菌范圍標準來自杭州微生物試劑有限公司。

1.7 血清型鑒定 取少量沙門菌A-F多價診斷血清于潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取綿羊血平板上純培養(yǎng)的待檢菌與之混勻進行玻片凝集試驗，同時設生理鹽水對照，2 min內觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。在診斷為沙門菌后，再使用O群診斷血清和H診斷血清進行凝集試驗。根據(jù)診斷結果查閱Kauffman-White沙門菌抗原式確定被檢菌的菌型。

2 結果

2.1 細菌分離 病料接種于血瓊脂平板培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)密布的小菌落,在麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)無色、針尖大小菌落。病料J1～J3對應編號為S1～S3。

2.2invA的PCR擴增 經過PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳分析，3個樣品均出現(xiàn)約330 bp目的條帶，分離菌株均為沙門菌。

2.3 生化試驗鑒定 細菌接種于微量生化反應管內，37 ℃培養(yǎng)48 h，鑒定結果顯示善株分離株不能發(fā)酵乳糖、蔗糖，能發(fā)酵果糖、葡萄糖、阿拉伯糖，不產生硫化氫，不產生吲哚，能還原硝酸鹽，V-P試驗呈陰性，甲基紅試驗呈陽性， 均基本符合沙門菌的生化特性。

2.4 藥敏試驗結果 藥敏試驗顯示，分離株對慶大霉素、頭孢噻肟、舒巴坦、妥布霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考有較高的敏感性；對多粘菌素B、鏈霉素、復方新諾明有較高的耐藥性。

2.5 血清型鑒定結果 3株分離菌株與沙門菌A-F多價血清進行玻板凝集試驗，結果均出現(xiàn)凝集反應。后用O群診斷血清、H診斷血清分別與分離菌株進行凝集試驗，結果顯示，分離株與O:9、O:12因子發(fā)生凝集，與H：g、H：m、H：q抗原發(fā)生凝集，因此，分離株的血清型均為[O9,12:H:g,m,q]，3株分離株皆為布利丹沙門菌。

3 討論

根據(jù)分離株的生長特性、生化特點以及invA鑒定，從送檢雞樣品中分離出沙門菌，血清型鑒定結果顯示，3株分離菌均為布利丹沙門菌。從藥物敏感試驗結果來看，3株分離菌對慶大霉素、頭孢噻肟、舒巴坦、左氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考有較高的敏感性，且3株分離菌存在略微的差異，這可能與養(yǎng)殖戶使用了不同的藥物有關。

雖然并未見布利丹沙門菌對養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害的報道，但該菌可引起人類感染，一般癥狀可表現(xiàn)為腹痛，腹瀉，嘔吐，發(fā)熱等。查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)[6-13]，布利丹沙門菌引起人類食物中毒多集中于夏季，由天氣炎熱、衛(wèi)生條件差、食材不新鮮、冰箱、工具等生熟混放、混用導致交叉污染等原因引起，一般經過3-4 d的治療便可痊愈。檢測出感染布利丹沙門菌的食物多為肉類及蛋類，推測為動物性食品本身攜帶，而天氣炎熱，衛(wèi)生條件差導致了細菌迅速繁殖及傳播[6-13]。高溫煮沸對細菌有殺滅作用，所以在食物中毒高發(fā)季節(jié)，應更重視對食品衛(wèi)生安全的監(jiān)測，提示人們在食品加工時一定要完全煮熟，并且避免工具的生熟混用。