地克珠利抗雞球蟲分子作用機理的研究進展

韓貞艷，畢菲菲，郝振凱，于詠蘭，索 勛，劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193)

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳球蟲寄生于雞腸道不同部位所引起的一種細胞內(nèi)寄生蟲病[1]。雞球蟲在田間廣泛存在，凡有雞的地方就有雞球蟲。雞球蟲病常見于規(guī)?；纳唐佛B(yǎng)雞場，發(fā)病率可達50%～70%，死亡率20%～30%，嚴重時可達80%。雞球蟲病導(dǎo)致飼料報酬率低，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]。

目前控制球蟲病的主要方法依靠抗球蟲藥物。迄今用于臨床的數(shù)十種抗球蟲藥物按其來源、化學(xué)結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)過程大致可分化學(xué)合成類藥物、聚醚類離子載體抗生素和草藥制劑等三大類。抗球蟲藥物主要通過影響細胞膜的功能(離子載體類)、阻礙能量代謝(喹諾酮，尼卡巴嗪等)、影響輔助因子的合成(磺胺類，氨丙啉等)、影響DNA(氟嘌呤類)或蛋白質(zhì)的合成(均三嗪類)等發(fā)揮抗球蟲作用[3]。但是隨著抗球蟲藥物的廣泛和長期使用，產(chǎn)生了十分嚴重的球蟲耐藥性問題。球蟲耐藥性的產(chǎn)生，一方面會導(dǎo)致藥物的防治效果不佳或失敗，藥物的使用年限縮短；另一方面為了能有效控制球蟲病的發(fā)生，需加大用藥劑量，從而增加養(yǎng)殖成本，造成藥物殘留，同時增加對環(huán)境的污染。因此，球蟲耐藥性問題不僅是雞球蟲病的防治問題，更是食品安全和公共衛(wèi)生問題。

地克珠利作為聚醚類的三嗪苯乙腈化學(xué)合成藥物，抗球蟲效果優(yōu)于作用于第1代裂殖體的聚醚類藥物和其他抗球蟲藥，具備高效、低毒、廣譜的抗球蟲效力。地克珠利在田間應(yīng)用廣泛應(yīng)用是在1990年，但是1994年就出現(xiàn)了關(guān)于地克珠利抗藥性的報道[4]。地克珠利耐藥性的出現(xiàn)促使球蟲國內(nèi)外學(xué)者對地克珠利作用的分子機制展開了研究。

1 地克珠利抗雞球蟲作用相關(guān)基因或蛋白

地克珠利作用柔嫩艾美耳球蟲后，柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子差異基因編碼的同源蛋白主要包括：柔嫩艾美耳球蟲的微線蛋白、表面抗原、肌動蛋白解聚因子、熱休克蛋白90、剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)的激活蛋白激酶C受體和環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶等[5]。另外研究者們發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶和絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶也很可能在抵抗地克珠利時發(fā)揮作用[6-7]。

1.1 乳酸脫氫酶 乳酸脫氫酶(LDH)是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生能量，對于寄生蟲的存活至關(guān)重要[5]。有研究結(jié)果表明，來自不同頂復(fù)門寄生蟲的乳酸脫氫酶相對于其宿主的乳酸脫氫酶具有獨特的動力學(xué)和結(jié)構(gòu)特性，因此是診斷和藥物篩選的潛在理想靶標[8]。有研究顯示，柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子中乳酸脫氫酶的mRNA水平高于未孢子化的卵囊、孢子化卵囊和子孢子這3個發(fā)育階段中的mRNA水平，乳酸脫氫酶的蛋白表達水平在第2代裂殖子中也最為突出，由此推測第2代裂殖子中乳酸脫氫酶的高度表達可能與其增加的能量需求相關(guān)聯(lián)——因為乳酸脫氫酶在糖酵解中起著不可或缺的作用，而糖酵解途徑是為內(nèi)源發(fā)育階段寄生蟲提供能量的必需代謝途徑，柔嫩艾美耳球蟲可依靠此途徑獲取能量維持生存[9]。據(jù)報道，柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶的RNA僅在裂殖體中能觀察到，表明其合成被限制在細胞內(nèi)階段[10]。

柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶的蛋白編碼區(qū)長度為996 bp，編碼331個氨基酸。有研究顯示，該基因在地克珠利耐藥株與敏感株的差別為在第 305位有1個氨基酸的差異，敏感株為谷氨酸，而耐藥株為甘氨酸[6]。在柔嫩艾美耳球蟲的不同發(fā)育階段，地克珠利敏感株乳酸脫氫酶mRNA的相對含量都明顯高于耐藥株；與之對應(yīng)的，在第2代裂殖子階段，地克珠利耐藥株的乳酸脫氫酶蛋白的相對表達量比敏感株下降了55.32%。該研究結(jié)果表明，長期的藥物誘導(dǎo)使柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶的基因表達水平發(fā)生了改變。由此推斷，地克珠利抗球蟲的作用機理可能和柔嫩艾美耳球蟲乳酸脫氫酶參與的糖酵解途徑有關(guān)。

1.2 蛋白激酶C受體蛋白 蛋白激酶C(PKC)是一種細胞質(zhì)酶，在未受刺激的細胞中，蛋白激酶C主要分布在細胞質(zhì)中，呈非活性構(gòu)象，一旦有第二信使的存在，蛋白激酶C將成為膜結(jié)合的酶，它能激活細胞質(zhì)中的酶，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時也能作用于細胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達的調(diào)控[11]。蛋白激酶C受體1(RACK1)在原核和真核生物高度保守，參與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，作用非常重要，其中在蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，蛋白激酶C受體1能夠與蛋白激酶C結(jié)合，調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性[12]。

柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白核苷酸序列全長1 264 bp，與來自弓形蟲的蛋白激酶C受體蛋白在氨基酸水平有98%的同源性[13]。柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白位于柔嫩艾美耳球蟲的第2代裂殖子中的細胞質(zhì)和細胞核，表明其可能作為細胞內(nèi)適配器廣泛的參與細胞活動并促進柔嫩艾美耳球蟲的侵襲力，是球蟲無性生殖階段第2代裂殖子階段是必不可少的一種蛋白。研究者通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白在第2代裂殖子階段發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白 mRNA的表達水平下降了81.3%[13]。柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白mRNA表達水平的下調(diào)可能會引起下游的蛋白質(zhì)功能發(fā)生障礙，抑制與入侵相關(guān)的分泌蛋白表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白mRNA表達水平的下調(diào)表明，柔嫩艾美耳球蟲蛋白激酶C受體蛋白可能存在地克珠利作用的靶點。

1.3 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)主要參與細胞的糖酵解途徑。近年來越來越多的研究表明，甘油醛-3-磷酸脫氫酶不僅是一種糖酵解酶，還是一種多功能蛋白，參與許多亞細胞活動，主要有催化微管聚合，參與蛋白磷酸化修飾、膜融合和膜轉(zhuǎn)運，促進細胞凋亡，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達以及參與DNA修復(fù)損傷作為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等，在其他多細胞生物上，甘油醛-3-磷酸脫氫酶的過量表達會導(dǎo)致細胞凋亡[14]。

地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脫氫酶mRNA表達水平顯著提高，第2代裂殖子細胞核中出現(xiàn)了大量的甘油醛-3-磷酸脫氫酶蛋白，并且柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子出現(xiàn)細胞核染色質(zhì)明顯減少、發(fā)生異染色質(zhì)化，凝集成大的黑色團塊、與核膜分離并發(fā)生趨邊化，線粒體脊模糊、斷裂，胞質(zhì)中出現(xiàn)了大量的空泡等細胞凋亡的典型癥狀[15]。地克珠利引起的柔嫩艾美耳球蟲的細胞凋亡可能與第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脫氫酶的累積有很大關(guān)系，地克珠利通過作用于甘油醛-3-磷酸脫氫酶發(fā)揮抗球蟲作用。

1.4 熱休克蛋白90 熱休克蛋白90(Hsp90)在應(yīng)激耐受性，新合成的蛋白質(zhì)折疊和各種生物的生長中起著重要作用[16]。在弓形蟲中，熱休克蛋白90對入侵宿主細胞和在宿主細胞內(nèi)生長是必需的[17]；在惡性瘧原蟲中，通過使用藥物格爾登霉素(GA)進行的抑制試驗證實了熱休克蛋白90參與惡性瘧原蟲在人類紅細胞中的生長[18]；有研究者用柔嫩艾美耳球蟲熱休克蛋白90產(chǎn)生的抗體預(yù)孵育子孢子，然后感染細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子孢子入侵率下降了75%，表明熱休克蛋白90能夠影響柔嫩艾美耳球蟲的侵襲能力[16]。

Shen[19]等研究了地克珠利對球蟲第2代裂殖子熱休克蛋白90的作用，試驗中兩組雞分別接種柔嫩艾美耳球蟲卵囊，試驗組雞從接種后96-120 h飼喂含1 mg/kg地克珠利飼料，對照組一直飼喂不含地克珠利飼料，收集接種柔嫩艾美耳球蟲120 h后盲腸中的第2代裂殖子，提取總RNA，并表達純化出熱休克蛋白90蛋白，然后利用qPCR的方法檢測熱休克蛋白90 mRNA的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地克珠利治療組熱休克蛋白90 mRNA的表達水平比對照組下降了29.7%，蛋白質(zhì)印跡分析發(fā)現(xiàn)地克珠利治療組的第2代裂殖子的熱休克蛋白90蛋白水平與對照組相比降低了50.0%。這些結(jié)果表明，地克珠利使第2代裂殖子中的熱休克蛋白90的表達水平下調(diào)，據(jù)此推測熱休克蛋白90是抗球蟲感染中一個潛在的地克珠利藥物靶標。

1.5 絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶是能夠催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子，與蛋白激酶相對應(yīng)存在，共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開關(guān)系統(tǒng)[20]。可逆蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化在細胞生命的大多數(shù)方面起著重要作用，包括細胞生長調(diào)節(jié)，分化，衰老和凋亡[21]。人類中有3種主要的蛋白磷酸酶，分別是酪氨酸磷酸酶(PTPase)、絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶(PPase)和雙重特異性磷酸酶(DSPase)[22]。根據(jù)去磷酸化的氨基酸殘基的不同，蛋白磷酸酶分成蛋白酪氨酸磷酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶(PP5，PPP5C)是哺乳動物組織中廣泛表達的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶基因家族的成員之一，已經(jīng)證實絲氨酸/蘇氨酸5型蛋白磷酸酶包含調(diào)節(jié)四肽多肽重復(fù)(TPR)結(jié)構(gòu)域，并且在許多細胞應(yīng)答中的信號通路中起作用[20]。

Zhou等[7]研究地克珠利對絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的作用時，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)克隆出柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶，并采用實時熒光定量PCR檢測了柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的mRNA表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地克珠利處理組柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的mRNA表達水平比未加地克珠利的對照組下降了51.4%。地克珠利作用后還引起柔嫩艾美耳球蟲第2代裂殖子的凋亡，其機制可能與絲氨酸/蘇氨酸5型蛋白磷酸酶的下調(diào)表達有很大關(guān)系。球蟲產(chǎn)生抗地克珠利藥物的靶點很有可能位于絲氨酸/蘇氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶這個基因上。

1.6 微線蛋白 微線是位于所有頂復(fù)門寄生蟲入侵階段前端的分泌細胞器，宿主細胞刺激后，微線蛋白在寄生蟲頂端分泌[23]。研究表明，一些微線蛋白質(zhì)作為專門的粘附素起作用，在寄生蟲運動和附著宿主細胞中有重要作用[24]。

地克珠利作用柔嫩艾美耳球蟲后，柔嫩艾美耳球蟲中的5種重要的與球蟲侵襲相關(guān)的微線蛋白的mRNA表達均發(fā)生了下調(diào)，其中微線基因1下調(diào)65.63%，微線基因2下調(diào)64.12%，微線基因3下調(diào)56.82%，微線基因4下調(diào)73.48%，微線基因5下調(diào)78.17%[25]。地克珠利作用球蟲后，影響了球蟲第2代裂殖時期微線基因的表達水平，推測地克珠利通過作用與入侵相關(guān)的微線基因發(fā)揮抗球蟲作用，微線基因可能是地克珠利作用的靶基因。

2 展望

當前對地克珠利抗雞球蟲的分子作用機理研究著重于研究與地克珠利作用可能相關(guān)的基因和蛋白。本文所述的地克珠利抗雞球蟲作用相關(guān)基因和蛋白是球蟲入侵、代謝及信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子。地克珠利作用后，這些基因或蛋白的表達量發(fā)生了不同程度的變化，地克珠利作用的位點很可能位于其中某個基因或蛋白上，但是有關(guān)地克珠利確切的調(diào)控機理及其相互之間的作用關(guān)系還需要進一步深入的研究。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，更多新技術(shù)在抗球蟲藥物領(lǐng)域得到運用，有望真正揭示球蟲抗地克珠利的分子機制。比如，可以通過實驗室分離或誘導(dǎo)地克珠利耐藥球蟲株，比較藥物敏感株和耐藥株在這些地克珠利可能作用的基因，篩選可能的耐藥基因的突變區(qū)域和突變位點，尋找地克珠利作用的靶基因位點，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對這些基因位點進行驗證。地克珠利以及其他抗球蟲藥物的靶基因或靶基因位點的發(fā)現(xiàn)，將對抗球蟲新藥的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。