青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠的影響

王艷琴，鄭 剛，，齊 婧，徐佳萌，楊 聰

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高，冠心病的發(fā)病率越來(lái)越高，已成為威脅人類生命健康的主要疾病。慢性心肌缺血綜合征是冠心病的主要類型，它是指冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟?。?］。治療心肌缺血的藥物眾多，如硝酸酯類藥物、β 受體拮抗劑、鈣離子通道阻滯劑等，還有改善預(yù)后的眾多藥物，如抗血小板聚集藥物、調(diào)脂類藥物等，但長(zhǎng)期服用副作用極大，急需尋求有效且副作用較小的治療方法。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯（SGB）通過(guò)降低交感與應(yīng)激反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)、防止氧化應(yīng)激等減少心肌缺血的發(fā)生［2‐5］。青藤堿來(lái)源于植物青風(fēng)藤的根莖，廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，動(dòng)物研究證明其具潛在消炎、鎮(zhèn)痛作用［6］，部分研究表明青藤堿在治療心血管疾病方面有一定療效，本課題組已有研究表明其在心臟病的治療方面療效頗著［7，8］，本次實(shí)驗(yàn)旨在研究青藤堿聯(lián)合SGB 治療對(duì)抑制交感、抗氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及緩解心肌缺血的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動(dòng)物 選擇SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，雌、雄各半，平均體重為180～200 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)：SCX 空白（川）2015‐030］，本實(shí)驗(yàn)大鼠均在陜西中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程均采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)鼠籠，分籠飼養(yǎng)，每籠5 只。在實(shí)驗(yàn)開始前，保證室內(nèi)溫度（20±2）℃、濕度（50%～55%）、正常通風(fēng)同等條件下進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由攝食SPF 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼料、高壓、高溫滅菌自來(lái)水。

1.1.2 主要試劑及配制 鹽酸青藤堿由陜西慧科植物開發(fā)公司提供，含量98%，生產(chǎn)批號(hào)：hk3992E5；鹽酸青藤堿注射液由陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備提供，規(guī)格20 mg/mL；鹽酸利多卡因注射液由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H14024045，規(guī)格：5 mL/0.1 g，加5 mL 生理鹽水配成濃度為1%的利多卡因注射液；垂體后葉素注射液：陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，生產(chǎn)批號(hào)：1190203，規(guī)格：1 mL/6 單位；水合氯醛由上海山浦化有限公司提供，加生理鹽水現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度：10%。

1.1.3 主要儀器及設(shè)備 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒均購(gòu)自武漢賽維爾科技有限公司（貨號(hào)：A001‐1、A003‐1）；白介素‐6（IL‐6）ELI‐SA 試劑盒（批號(hào)：A30600115）、肌鈣蛋白I 試劑盒（貨號(hào)：CB‐E30062R）；全自動(dòng)生化分析儀、電子分析天平、離心管、EDTA+空白2 抗凝管、采血針、眼科鑷子、剪刀、醫(yī)用注射器（1、2.5 mL）、移液槍、槍頭（200 μL）、75%酒精、醫(yī)用棉球等均為咸陽(yáng)市秦都區(qū)博泰化玻璃儀器經(jīng)銷部提供。

1.2 動(dòng)物分組、造模及處理

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 實(shí)驗(yàn)大鼠40 只適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組，每組10 只，空白組10 只，飼喂普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，不造模，共8 周；剩余30 只大鼠喂高脂飼料（高脂飼料配方：1.25%膽固醇+15%豬油+0.5%膽酸鈉+9%蔗糖+6%全乳脂蛋白+68.25%普通飼料），共飼喂8 周，誘導(dǎo)血管脂質(zhì)沉積；實(shí)驗(yàn)第8 周末高脂飲食飼喂大鼠與普通飼料喂養(yǎng)大鼠血脂有明顯差異后，隨機(jī)分為3 組，每組10 只。模型組第10 周開始給予右側(cè)星狀神經(jīng)節(jié)（RSG），注射0.9%NaCl 0.24 mL 連續(xù)2 周，注射前給予10%水合氯醛1/3 劑量進(jìn)行輕度麻醉，后于大鼠舌下靜脈連續(xù)注射3 d 垂體后葉素注射液（0.5 U/kg，5 s 內(nèi)推注完），注射前大鼠禁食8 h，1 次/24 h，于第3 天注射前連接心電圖，觀察心肌缺血變化；利多卡因組給予RSG，注射1% 利多卡因注射液0.24 mL，余同模型組；青藤堿+利多卡因組大鼠給予RSG 注射1%利多卡因注射液0.24 mL+鹽酸青藤堿0.095 mL+0.9%生理鹽水2.9 mL，共0.8 mL，余同模型組；空白組未進(jìn)行任何干預(yù)措施。

1.2.2 造模成功及SGB 成功的標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)心電圖ST 段變化及血清cTnI 改變判斷心肌缺血造模是否成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血比較各組大鼠血清肌鈣蛋白I 水平［9］；SGB 前后5 min，讓動(dòng)物自由活動(dòng)，觀察兩側(cè)眼瞼、眼裂的變化。發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組阻滯后與阻滯前比較，出現(xiàn)霍納綜合征，即上瞼下垂，眼裂變窄等表現(xiàn)［10］。

1.2.3 取材及檢測(cè) 各組大鼠共喂養(yǎng)11 周，每次給藥后1～2 h 觀察大鼠一般狀態(tài)；于末次垂體后葉素注射液注射前后觀察心電圖變化：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠于腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清氧化應(yīng)激及炎癥因子指標(biāo)SOD、MDA、IL‐6 及CTnI 水平變化。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般狀態(tài) 在藥物SGB 干預(yù)兩周內(nèi)，每次給藥后1～2 h 觀察。

1.3.2 心電圖 動(dòng)物麻醉后將連接PowerLab 生物信號(hào)系統(tǒng)電極的6 號(hào)針頭分別插入大鼠前肢和下肢皮下，采用PowerLab 生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，記錄標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，描記系統(tǒng)由電腦操作，分別記錄注射前（0 s）及注射后第10、20、30 分鐘心電圖變化，觀察心電圖陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：（1）ST 段水平向下或向上偏移>0.1 mV；（2）T 波高聳超過(guò)同導(dǎo)聯(lián)R 波的1/2；（3）T 波高聳伴ST 段移位。具備以上條件之一者即可判斷為缺血陽(yáng)性［11］。

1.3.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 與MDA、炎癥反應(yīng)指標(biāo)IL‐6 及CTnI 的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠腹主動(dòng)脈采血5 mL，3 000 r/min 離心20 min，分離血清，4℃保存，測(cè)定SOD、MDA、IL‐6、CTnI 指標(biāo)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)均以（±s）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

給藥后各組大鼠行為均無(wú)異常，無(wú)煩躁不安、發(fā)熱、昏厥、行動(dòng)遲緩或其他異常情況，給藥后大鼠處于輕度麻醉狀態(tài)，持續(xù)5～6 min 后即可恢復(fù)正常。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組大鼠死亡2 只，利多卡因組大鼠死亡1 只，利多卡因+青藤堿組大鼠死亡1 只。觀察各組大鼠食欲正常，飲水正常。藥物SGB 對(duì)大鼠死亡影響較小，無(wú)其他不良影響。

2.2 心電圖

各組大鼠注射垂體后葉素后心電圖表現(xiàn)各異，注射前后1 min 之內(nèi)大鼠心率變慢、心肌缺血程度加重。模型組大鼠10 min 時(shí)ST 段抬高明顯，20 min 后即開始下降，30 min 時(shí)仍有缺血改變；利多卡因組大鼠10 min 時(shí)ST 段抬高一般，20 min 后即開始明顯下降，30 min 時(shí)幾乎無(wú)缺血改變；利多卡因+青藤堿組大鼠10 min 時(shí)ST 段抬高程度較小，20 min 及30 min 幾乎無(wú)缺血改變；與空白組比較，模型組、利多卡因組、利多卡因+青藤堿組心電圖變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），表明造模成功。見表1。

表1 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠心電圖影響（mV，±s）Tab 1 Effects of sinomenine stellate ganglion block on ECG of rats with chronic myocardial ischemia（mV，±s）

表1 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠心電圖影響（mV，±s）Tab 1 Effects of sinomenine stellate ganglion block on ECG of rats with chronic myocardial ischemia（mV，±s）

注：與空白組比較，#P<0.05,##P<0.01。

30 min 0.046±0.004 0.147±0.035##0.061±0.043##0.085±0.014##組別空白組模型組利多卡因組利多卡因+青藤堿組n 10 899 10 min 0.042±0.002 0.213±0.065##0.071±0.080##0.135±0.212#20 min 0.054±0.003 0.189±0.050##0.075±0.058##0.105±0.014##

2.3 CTnI

與空白組相比，模型組、利多卡因組、利多卡因+青藤堿組CTnI 值均升高，其中模型組CTnI 值最高，模型組和利多卡因組與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）；與模型組比較，利多卡因組、利多卡因+青藤堿組CTnI 值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），提示心肌缺血壞死因子產(chǎn)生，模型建立成功。見表2。

表2 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠CTnI 的影響（ng/mL，± s）Tab 2 Effect of sinomenine stellate ganglion block on cTnI in rats with chronic myocardial ischemia（ng/mL，±s）

表2 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠CTnI 的影響（ng/mL，± s）Tab 2 Effect of sinomenine stellate ganglion block on cTnI in rats with chronic myocardial ischemia（ng/mL，±s）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

CTnI 304.68±70.95 562.50±86.54**446.14±62.37*#330.77±91.80#組別空白組模型組利多卡因組利多卡因+青藤堿組n 10 899

2.4 SOD 與MDA

與空白組相比，模型組SOD 值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，利多卡因組、利多卡因+青藤堿組SOD 值明顯升高，其中利多卡因+青藤堿組SOD 值最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與空白組比較，模型組MDA 值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，利多卡因組、利多卡因+青藤堿組MDA 值明顯降低，其中利多卡因+青藤堿組MDA 值最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）；結(jié)果提示青藤堿SGB 可以提高各高脂血癥心肌缺血大鼠組的SOD，降低MDA，從而達(dá)到抗氧化應(yīng)激損傷的作用。見表3。

表3 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠SOD 與MDA的影響（±s）Tab 3 Effects of sinomenine stellate ganglion block on SOD and MDA in rats with chronic myocardial ischemia（±s）

表3 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠SOD 與MDA的影響（±s）Tab 3 Effects of sinomenine stellate ganglion block on SOD and MDA in rats with chronic myocardial ischemia（±s）

注：與空白組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

MDA（nmoL/mL)5.19±0.85 7.03±0.69**5.90±1.21#5.67±1.03##組別空白組模型組利多卡因組利多卡因+青藤堿組n 10 899 SOD 活力（U/mL）472.32±20.65 404.02±48.35*482.04±92.07##507.73±27.96##

2.5 IL‐6

與空白組比較，模型組IL‐6 值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相比，利多卡因組、利多卡因+青藤堿組大鼠均明顯降低，利多卡因+青藤堿組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01），表明青藤堿SGB 可以降低大鼠IL‐6 值，從而達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用。見表4。

表4 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠IL-6 的影響（pg/mL，± s）Tab 4 Effect of sinomenine stellate ganglion block on IL-6 in rats with chronic myocardial ischemia（pg/mL，±s）

表4 青藤堿星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)慢性心肌缺血大鼠IL-6 的影響（pg/mL，± s）Tab 4 Effect of sinomenine stellate ganglion block on IL-6 in rats with chronic myocardial ischemia（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P<0.05；**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

IL‐6 154.70±30.11 252.72±35.53**208.51±49.73*#187.58±39.61##組別空白組模型組利多卡因組利多卡因+青藤堿組n 10 899

3 討論

心肌缺血是心臟重塑、心肌梗死、心力衰竭等疾病的主要原因之一［12］。慢性心肌缺血為臨床常見病理過(guò)程，是多種心肌疾病及心衰的起始過(guò)程，其發(fā)生涉及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌氧化應(yīng)激、氧自由基生成、心肌能量代謝、自噬等多種病理過(guò)程。研究表明，SGB 明顯降低血清CTnI 和心肌肌鈣蛋白T 水平，減輕ST 段抑制和氧化產(chǎn)生水平，但增加抗氧化酶水平［9］。在降低一氧化氮和MDA 水平以及提高SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、神經(jīng)元型一氧化氮合酶和內(nèi)皮型一氧化氮合酶水平方面，右側(cè)SGB 的保護(hù)作用強(qiáng)于左側(cè)。SOD 是體內(nèi)抗自由基生成的一種抗氧化酶，其含量多少可以反映機(jī)體清除氧化應(yīng)激過(guò)程的能力；MDA 是機(jī)體發(fā)生損傷脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的一種病理產(chǎn)物，其含量高低能夠反映機(jī)體受氧化攻擊程度［13，14］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)血清SOD 和MDA 含量，證實(shí)了SGB 可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激來(lái)改善心肌缺血狀態(tài)。

此外，炎癥反應(yīng)也是急性心肌梗死的病理研究機(jī)制之一，炎癥是由血管損傷引起的一個(gè)有序的過(guò)程，它會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的白細(xì)胞黏附性、趨化性，并最終在原位激活。細(xì)胞因子IL‐6 是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎性因子，是治療各種炎癥和自身免疫性疾病的主要治療靶點(diǎn)［15］，與心肌缺血性損傷關(guān)系密切。研究顯示SGB 預(yù)處理能夠通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路進(jìn)而抑制炎癥因子反應(yīng)達(dá)到保護(hù)大鼠體外循環(huán)后腦損傷作用［16，17］。青藤堿是中藥青風(fēng)藤的主要藥用成分，有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、擴(kuò)血管降壓、抗心律失常等藥理作用［18］。有研究發(fā)現(xiàn)青藤堿可抑制NF‐κB 信號(hào)通路，抑制信號(hào)通路中炎性物質(zhì)表達(dá)，減弱異丙腎上腺素注射小鼠誘導(dǎo)的心肌肥厚及提高IL‐10/IL‐17 的比例，抑制I 型和Ⅲ型膠原蛋白的mRNA 和蛋白質(zhì)水平，改善心衰狀態(tài)［19，20］。本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了青藤堿SGB 可降低大鼠IL‐6 水平進(jìn)而改善心肌缺血狀態(tài)。

與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠血脂水平明顯提升，心電圖ST 段明顯改變，CTnI 升高，表明造模成功；經(jīng)鹽酸青藤堿SGB 干預(yù)后增加SOD 的生成，減少M(fèi)DA 及IL‐6 的釋放，同時(shí)心電圖改變也相應(yīng)減輕、CTnI 減少，表明青藤堿SGB 干預(yù)通過(guò)抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)進(jìn)而改善大鼠心肌缺血狀態(tài)，通過(guò)比較單獨(dú)使用利多卡因SGB 及使用中草藥制品青藤堿聯(lián)合利多卡因SGB，表明聯(lián)合效果更佳。

有臨床實(shí)踐證明青藤堿聯(lián)合利多卡因行SGB可以達(dá)到僅用麻醉劑達(dá)不到的效果，既可以阻滯交感神經(jīng)節(jié)，抑制交感，而且可以消除心肌缺血所反映到星狀神經(jīng)節(jié)的炎癥，雙重緩解心肌缺血，所以青藤堿SGB 可以改善氧化應(yīng)激、炎癥及交感神經(jīng)達(dá)到抗心肌缺血作用。本次實(shí)驗(yàn)研究證明青藤堿聯(lián)合利多卡因SGB 在改善心肌缺血方面效果顯著，后續(xù)有望進(jìn)一步深入研究其作用靶點(diǎn)，為臨床提供可靠的治療方法。然而本次實(shí)驗(yàn)研究青藤堿+利多卡因組劑量高于其他各組，可能劑量差異導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性，且研究的大鼠數(shù)量較少，今后采用更大樣本的動(dòng)物數(shù)量來(lái)證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

王艷琴：選題與設(shè)計(jì)，資料的分析與解釋，撰寫并修改整個(gè)論文；鄭剛：選題與設(shè)計(jì)，修改論文中關(guān)鍵性理論；齊婧：參與課題的整個(gè)過(guò)程；徐佳萌、楊聰：修改論文中的其他主要內(nèi)容。