大蒜提取物對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

綦國紅 巴云英 楊志萍 陳貴堂 王海翔

摘要：研究大蒜提取物對熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物膜形成的抑制作用。用結(jié)晶紫染色法以及光學顯微鏡對該菌產(chǎn)生的生物膜進行了研究，苯酚硫酸法測定其胞外多糖的產(chǎn)量，采用多孔板法研究了大蒜提取物與山梨酸鉀的協(xié)同作用。結(jié)果表明，大蒜提取物濃度為100、150 mg/mL時，對生物膜的抑制率分別為27.6%和38.7%;對胞外多糖抑制率分別為4.5%和12.6%;100 mg/mL的提取物與山梨酸鉀具有協(xié)同作用。因此，大蒜提取物對熒光假單胞菌生物膜的形成具有抑制作用。

關鍵詞：熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）;生物膜;大蒜提取物

中圖分類號：TS255.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）23-0157-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.039? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Inhibitory effect of garlic extract on the biofilm formation of Pseudomonas fluorescens

QI Guo-hong，BA Yun-ying，YANG Zhi-ping，CHEN Gui-tang，WANG Hai-xiang

（School of Engineering，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Abstract： The inhibitory effect of garlic extract on biofilm development in Pseudomonas fluorescens was studied. The biofilm produced by the bacteria was determined using crystal violet staining and light microscope， phenol sulfuric acid method was used to test the production of extracellular polysaccharides， the synergistic effect of garlic extract with potassium sorbate was studied by porous plate method. The results showed that the inhibitory rates of garlic extract on biofilm development were 27.6% and 38.7%， the inhibitory rates on extracellular polysaccharide were 4.5% and 12.6%， respectively， at the concentration of the garlic extract 100 mg/mL and 150 mg/mL， garlic extract showed synergistic effect with potassium sorbate at the concentration of 100 mg/mL. Therefore， garlic extract inhibited the biofilm formation in P. fluorescens.

Key words： Pseudomonas fluorescens; biofilm; garlic extract

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）廣泛分布于土壤、水、植物等自然生物鏈之中，是一種常見的嗜冷菌，常存在于魚、肉、奶等動物性食品中，并在冷藏過程中大量生長，導致該類食品的腐敗變質(zhì)。而且該菌在生長的過程中產(chǎn)生生物被膜[1]。生物被膜（又稱生物膜）是細菌為了適應生存環(huán)境黏附并包被于自體產(chǎn)生的黏液性不均一聚合基質(zhì)中，形成一種與浮游細胞不同生長方式的群體，而多糖是生物膜主要的構(gòu)成成分之一。由于生物膜的形成對環(huán)境因素的耐受性比浮游菌增加10～1 000倍，所以對抗生素以及食品防腐劑、殺菌劑的抗性明顯增強，很難從食品接觸面和加工設備上清除，對食品的貯藏和加工帶來嚴重危害[2，3]。因此，研究如何抑制或減少熒光假單胞菌生物膜的形成對食品工業(yè)具有重要意義。

大蒜（Garlic）屬百合科蔥屬植物，以鱗莖入藥，含有多種有益于人體健康的功效成分，同時具有抗菌作用，對細菌、真菌及病毒等感染均有一定的療效[4]，但是有關大蒜對生物膜形成的抑制作用的報道卻較少。為更好地控制熒光假單胞菌生物膜的產(chǎn)生，增強其對各種防腐劑、殺菌劑的敏感性，本文研究大蒜提取物對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用，為大蒜的進一步應用提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 菌種與培養(yǎng)條件

熒光假單胞菌P2為實驗室保存。使用LB培養(yǎng)基（氯化鈉10 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，去離子水1 L，pH 7.0）于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.2? 材料與試劑

白皮大蒜購自于當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場;甲苯（分析純），上海凌峰化學試劑有限公司;苯酚（分析純）， 國藥集團化學試劑有限公司;濃硫酸（分析純），南京化學試劑股份有限公司;胰蛋白胨（生物試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司;酵母粉，Oxoid Ltd。

1.3? 儀器與設備

HZC-250恒溫震蕩培養(yǎng)箱（蘇州太倉實驗設備有限公司）;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）;Elx800多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司;Microscope? Eclipse 80i光學顯微鏡（日本Nikon）。

1.4? 方法

1.4.1? 大蒜提取物的制備? 按文獻[4]方法，稱取 150 g蒜粒，加300 mL甲苯，粉碎機將蒜粒搗成糊狀，靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，得上清液，加入150 mL去離子水，攪拌混勻，室溫靜置24 h，得水相，無菌過濾，分裝，-18℃保藏，備用。粗提物的濃度為1 g/mL。

1.4.2? 對熒光假單胞菌最小抑菌濃度（MIC）的測定? ?按文獻[4]方法，P2活化后，按1%接種量接種于新鮮LB培養(yǎng)基，28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm約為0.4。取菌液與提取物按比例混合，大蒜提取物最終濃度分別為200、250、300、350、400、450、500 mg/mL。對照組為LB培養(yǎng)基。于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)14 h，觀察各試管生長情況，無菌生長的試管對應的濃度即為最小抑菌濃度。

1.4.3? 對熒光假單胞菌生長的抑制作用? 按“1.4.2”方法制備含有不同濃度大蒜提取物的菌液后進行培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取200 μL培養(yǎng)液加入96孔板中用酶標儀測定OD630 nm值，繪制成生長曲線。

1.4.4? 對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

1）光學顯微鏡對生物膜的定性觀察。按“1.4.2”方法制備含有不同濃度提取物的菌液，分裝于錐形瓶中，將0.5 cm×0.5 cm的無菌輸液管片置于錐形瓶內(nèi)，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，添加新鮮LB培養(yǎng)基和提取物后繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h。取出輸液管片，無菌水沖洗，干燥，染色。用光學顯微鏡觀察（400×），拍照，具體參見文獻[4]。

2）對生物膜的定量測定。參照文獻[5]按1）方法操作，干燥、染色后輸液管片用無水乙醇洗脫3 min， 取200 μL洗脫液加入96孔板中，酶標儀于570 nm測吸光度。按下式計算抑制率：

抑制率（%）=×100%

1.4.5? 對胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用? 按文獻[5]方法，P2培養(yǎng)至OD600 nm值約為0.4，分裝至錐形瓶，加入不同濃度的提取物，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。取菌液4 000 r/min離心20 min，得上清液，取1 mL上清液至5 mL無菌離心管中，加入3倍體積的冷乙醇（AR），混合均勻后于4 ℃冰箱中靜置24 h，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，得沉淀，用2倍體積的無菌水稀釋，用苯酚硫酸法測定胞外多糖[6]。

1.4.6? 與防腐劑的協(xié)同作用? 根據(jù)文獻[7]，P2接種于新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600 nm值約為0.4后，進行分組試驗，對照組不加山梨酸鉀，不加提取物;試驗組一組加山梨酸鉀，加提取物，另一組加山梨酸鉀，不加提取物。每組加入等體積菌液，山梨酸鉀最終濃度為10或5 mg/mL。大蒜提取物最終濃度為100 mg/mL。28 ℃靜置培養(yǎng)24 h，酶標儀測定OD630 nm值，按2）中的公式計算抑制率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）

對培養(yǎng)物生長情況進行觀察，提取物濃度為400 mg/mL的培養(yǎng)管無菌生長，大蒜提取物對熒光假單胞菌的MIC為400 mg/mL。

2.2? 對熒光假單胞菌生長的抑制作用

為進一步確定提取物在MIC濃度下對P2生長的抑制作用，對生長曲線進行了測定，并進行了顯著性檢驗（圖1）。提取物濃度為100、150 mg/mL時對P2的生長過程以及最大生長量均無抑制作用，而濃度為200 mg/mL時對P2的生長具有抑制作用，因此選100、150 mg/mL濃度進行下一步試驗。

2.3? 對熒光假單胞菌生物膜形成的抑制作用

結(jié)果如圖2所示，添加了大蒜提取物的生物膜與對照相比，細菌密度、團塊體積均變小。提取物濃度增加，細菌密度、團塊體積變小。定量測定結(jié)果表明，大蒜提取物濃度為100、150 mg/mL時對P2生物膜的抑制率分別為27.6%和38.7%（圖3），抑制率隨著提取物濃度的增大而增大。說明測試濃度的提取物在不影響P2生長的條件下，可以抑制P2生物膜的形成。

2.4? 對胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用

多糖是細菌被膜的主要成分之一[6，7]，所以可以通過測定胞外多糖的產(chǎn)生量進一步印證提取物對生物膜形成的影響。由圖4可知，大蒜提取物濃度在100、150 mg/mL時對P2胞外多糖產(chǎn)生均有抑制作用，抑制率分別是4.5%和12.6%。由于多糖是生物膜的構(gòu)成成分之一，所以同樣濃度條件下大蒜提取物對多糖的抑制率遠低于對生物膜的抑制率[8]。

2.5? 與山梨酸鉀的協(xié)同作用

由圖5可知，山梨酸鉀濃度為10或5 mg/mL時，添加100 mg/mL大蒜提取物后與不添加提取物相比，對P2生長的抑制作用均有所增強，說明大蒜提取物和山梨酸鉀對P2的生長具有協(xié)同抑制作用。添加大蒜提取物可以增加P2對山梨酸鉀的敏感性。

3? 小結(jié)與討論

本文研究了大蒜提取物對熒光假單胞菌P2生物膜形成的抑制作用。結(jié)果表明，大蒜提取物濃度在100、150 mg/mL時，對P2生長無抑制作用，但對其形成的生物膜的抑制率分別為27.6%和38.7%;對胞外多糖抑制率分別為4.5%和12.6%;大蒜提取物濃度為100 mg/mL時，與10、5 mg/mL的山梨酸鉀均有協(xié)同作用。即提取物在非抑菌濃度下，對熒光假單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，增強了熒光假單胞菌對防腐劑山梨酸鉀的敏感性，有利于生物膜的破壞與清除，對生產(chǎn)上應用有非常重要的意義。該抑制作用可能是由于對熒光假單胞菌P2群體感應抑制所致，但其中的功能成分需進一步研究。

參考文獻：

[1] 高? 琳，陳萬義，任? 婧.食品中熒光假單胞菌的危害及其快速檢測方法研究進展[J].食品工業(yè)科技，2015，36（16）：373-377.

[2] 黃訊辰，戴賢君.熒光假單胞菌生物膜的定性觀察及影響因素研究[J].食品科技，2015，40（6）：14-18.

[3] 李婷婷，崔方超，馬? 艷，等.群體感應AHLs對溫和氣單胞菌體外致腐因子分泌的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017，43（3）：54-60.

[4] 丁榮榮，陳貴堂，楊志萍，等.大蒜提取物對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017，43（2）：86-90.

[5] PACKIAVATHY I A S V，PRIYA S，PANDIAN S K，et al. Inhibition of biofilm development of uropathogens by curcumin-Ananti-quorum sensing agent from Curcuma longa[J].Food Chem，2014，148：453-460.

[6] 趙? 麗.P.fluorenscens發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的結(jié)構(gòu)分析及活性評價[D].山東青島：中國海洋大學，2013.

[7] 謝紅梅，胡必杰，周昭彥，等.銅綠假單胞菌生物膜形成影響因素的研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2007，17（12）：1475-1501.

[8] PACKIAVATHY I A S V，AGILANDESWARI P，MUSTHAFA K S，et al. Antibiofilm and quorum sensing inhibitory potential of Cuminum cyminum and its secondary metabolite methyl eugenol against Gram negative bacterial pathogens[J].Food Res Int，2012，45：85-92.