約氏乳酸桿菌中一種新的阿魏酸酯酶基因的克隆表達(dá)與性質(zhì)研究

張 強(qiáng)， 白亞軍， 蔡宇杰*， 鄭曉暉

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710069）

阿魏酸酯酶（Feruloyl esterases，F(xiàn)AEs），另一名稱是肉桂酸酯酶，它屬于羧酸酯水解酶類，通常植物細(xì)胞中的阿魏酸與多糖連接的酯鍵就是由它水解的，釋放出游離的阿魏酸。它可以裂解植物細(xì)胞壁中的酯鍵，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而可以創(chuàng)造出更多的生物資源，因此在生物資源開發(fā)方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。自從1987年第一次從Streptomyces olivochromogenes中發(fā)現(xiàn)以來，相繼已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種真菌，細(xì)菌都能分泌FAEs。目前已知的產(chǎn)FAEs的微生物主要有乳酸桿菌 （Lactobacilli）， 黑曲霉（Aaspergillusniger）， 鏈 霉 菌 （Streptomyces avermitilis），黃柄曲霉（Aspergillus flavipes）等[1]。 并且大部分的FAEs是從真菌中分離出來的[2]。

自1991年第一個(gè)FAEs純化以來，現(xiàn)如今已有30多種FAEs得到了純化[3]。純化的FAEs在分子量、等電點(diǎn)、最適反應(yīng)條件等物理化學(xué)特性方面都各不相同[4]。有報(bào)道表明單糖和雙糖不支持微生物產(chǎn)FAEs，含有阿魏酸酯鍵的底物能誘導(dǎo)產(chǎn)FAEs。

植物細(xì)胞壁之所以這么堅(jiān)硬，就是阿魏酸在其中起著舉足輕重的作用。它可以在半纖維素與半纖維素之間，木質(zhì)素與木質(zhì)素之間，半纖維素與木質(zhì)素之間形成連接，形成一個(gè)網(wǎng)狀的骨架結(jié)構(gòu)[5]。此外，釋放的阿魏酸是一種生理活性物質(zhì)，對(duì)它可以進(jìn)行進(jìn)一步的加工處理，開發(fā)出更多的藥用或保健等經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品[6]。

本文從實(shí)驗(yàn)室保藏菌中篩選產(chǎn)阿魏酸酯酶的乳酸桿菌，對(duì)其基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析。并利用大腸桿菌工程菌異源表達(dá)可能的阿魏酸酯酶基因以驗(yàn)證其酶活活性，對(duì)其分離純化后，進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 菌株為約氏乳酸桿菌株，Lactobacillus johnsoniiNBC455（由江南大學(xué)食品學(xué)院陳衛(wèi)課題組惠贈(zèng)）。大腸桿菌E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α、質(zhì)粒 pColdⅡ。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 10，pH 7.0～7.4，115 ℃滅菌 20 min，LB平板需添加額外2%的瓊脂。

LB-氨芐青霉素（Amp）培養(yǎng)基（g/L）：LB 培養(yǎng)基滅菌冷卻至40～50℃后加入Amp，終質(zhì)量濃度為0.1 mg/L。

1.1.3 主要試劑 基因工程操作用酶，包括限制性內(nèi)切酶 （XbaⅠ、BamHⅠ）、T4DNA 連接酶、DNA 聚合酶、核酸電泳DNA marker、核酸電泳 Loading Buffer、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白購于大連TaKaRa公司；氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖（IPTG）、引物、柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒小量純化試劑盒Plasmid Purification Kit均從上海生工購買；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）；高壓細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）；HYL-C組合式搖床（太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DYY-8C型電泳儀 （北京市六一儀器廠）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M湘儀）；AKTA avant蛋白純化系統(tǒng)（美國通用公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad）；PCR 儀（美國 Applied Biosystems）；高效液相色譜PerkinElmer Series225（廣東省設(shè)備廠）；掃描型紫外可見分光光度計(jì) UV－3900（日本日立）。

1.2 方法

1.2.1 約氏乳酸桿菌總DNA的提取 （1）在3 mL LB培養(yǎng)基中加3 μL氨芐青霉素，加3 μL甘油管中的菌液，37℃培養(yǎng) 12 h。（2）取2 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清。（3）按柱式細(xì)菌DNAout試劑盒的方法提取基因組DNA，保存在-20℃冰箱中。（4）通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度大小。

1.2.2 設(shè)計(jì)引物及PCR擴(kuò)增 通過序列比對(duì)，根據(jù)保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)引物，劃線處的兩個(gè)酶切位點(diǎn)分別為SacⅠ和XbaⅠ。

引 物 1：5'GCCGGAGCTCATGAGAACTGGTAC TAAAATTATTA 3'

引 物 2：5'GCCGTCTAGACTATTCACCTTTAAA CCTACCA 3'

以Lactobacillus johnsoniiNBC455基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收，電泳驗(yàn)證一條帶。

1.2.3 PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒的雙酶切和連接 將質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。質(zhì)粒酶切體系：10×cut buffer 5 μL，質(zhì)粒 10 μL，SacⅠ和 XbaⅠ各 0.5 μL，無菌水 34 μL 共 50 μL。 PCR 產(chǎn)物酶切體系：10×cut buffer 3 μL，DNA 4 μL，NdeⅠ和XbaⅠ各 0.5μL，無菌水 2 μL 共 30 μL。 37 ℃水浴中切 1 h。將DNA片段克隆到pCold-ⅡVector上，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。連接體系：10×DNA ligase buffer 2.5 μL，DNA 片段 8 μL，載體 DNA 2 μL，T4DNA ligase 1 μL，無菌水 11.5 μL 共 25 μL。16 ℃水浴下連接12～16 h。

1.2.4 制備大腸桿菌感受態(tài) （1）接種E.coli DH5α和 BL21（DE3）分別于含有20 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。（2）按1%接種量接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600約 0.6（約 2～3 h）。（3）將菌液轉(zhuǎn)移到 50 mL預(yù)冷的離心管中，冰上放置30 min，8 000 r/min、4℃離心 5 min。（4）棄上清，加入 5 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，使菌體懸浮，冰上放置20 min，8 000 r/min、4 ℃離心 5 min。重復(fù) 2次。（5）棄上清，加入1.5 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，含有15%的甘油，輕輕懸浮菌體，然后100 μL分裝到1.5 mL離心管中，-70℃冰箱保藏備用。

1.2.5 重組大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá) （1）重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL2L大腸桿菌感受態(tài)中。（2）加入1 mL不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃搖1 h使菌復(fù)蘇。（3）取50 μL涂布在含氨芐的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上。（4）37℃培養(yǎng)12 h左右。（5）挑平板上菌接到小試管37℃培養(yǎng)過夜。（6）部分保存甘油管，加500 μL到50 mL搖瓶，之前加50 μL氨芐。37℃培養(yǎng)2.5 h，15℃下靜置0.5 h，在超凈工作臺(tái)中加20 μL的IPTG。15℃下培養(yǎng)24 h（搖床均設(shè)置為250 r/min）?？蛰d體轉(zhuǎn)化的BL21同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。（7）離心收集菌體（8 000 r/min，5 min），20 mmol緩沖液復(fù)溶。

1.2.6 SDS-PAGE及蛋白含量的檢測(cè) （1）SDSPAGE凝膠電泳。根據(jù)Laemmli[7]方法，在1 mL小試管中加入10 μL上樣buffer，加40 μL細(xì)胞破碎上清液，煮沸10 min。同時(shí)空質(zhì)粒表達(dá)的也要進(jìn)行電泳檢測(cè)。用12%的分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以用來初步判定蛋白表達(dá)情況和后面純化分離情況。（2）蛋白濃度檢測(cè)。根據(jù)Bradford考馬斯亮藍(lán)法[8]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度。取0.1 mL酶液，0.9 mL蒸餾水，加5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑盒染液，反應(yīng)5 min后測(cè)定OD595的吸光值。同時(shí)測(cè)定純酶的蛋白濃度。

1.2.7 酶活測(cè)定方法 酶活測(cè)定方法為：4 mL反應(yīng)體系，包含 3 mL 磷酸緩沖液（0.02 mol/L，pH 6.0），0.5 mL底物溶液（4 mg/mL），0.5 mL酶液，35℃反應(yīng)4 h，高溫100℃加熱終止反應(yīng)，以緩沖液替換酶液作為對(duì)照反應(yīng)。用高效液相色譜[9]檢測(cè)底物和產(chǎn)物的含量。高效液相色譜檢測(cè)條件為：0～15 min為10%乙腈，90%水 （0.1%甲酸）；15～20 min為100%乙腈，0%水；20～30 min為 10%乙腈，90%水（0.1%甲酸）。定義酶活力：每分鐘氧化1 μmol底物為產(chǎn)物所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.8 重組蛋白的初步分離純化 得到的粗酶液用AKTA avant蛋白純化儀[10]進(jìn)行鎳柱純化，將A1、A2、B1、B2四根管路都放進(jìn)水里，設(shè)置system flow 20 mL/min流速，進(jìn)行排氣。之后把A1放進(jìn)結(jié)合液中，B1放進(jìn)洗脫液中，再進(jìn)行排氣一次，然后設(shè)置system flow 1 mL/min、flow path（column position 3）、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0，inset A1平衡10 min后裝柱子。然后上樣粗酶液，用500 mmol/L的高濃度咪唑緩沖液B1洗脫目的蛋白，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來，收集有酶活的洗脫液用超濾管（30 kDa）進(jìn)行濃縮。SDS-PAGE驗(yàn)證純化后蛋白條帶是否單一。

1.2.9 酶學(xué)性質(zhì) （1）最適溫度分析。以阿魏酸甲酯為底物研究溫度對(duì)本發(fā)明所述酯酶酶活的影響，將酯酶分別在20～70℃下測(cè)定其酶活，將酯酶置于40、50、60與70℃下處理3 h，分別測(cè)定剩余酶活。（2）最適pH分析。以阿魏酸甲酯為底物研究pH對(duì)本發(fā)明所述酯酶酶活的影響，將酯酶分別置于pH值為3～9的緩沖液中處理96 h，測(cè)定剩余酶活。（3）反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定。加相同量的酶液到不同底物濃度的反應(yīng)液中，在最適溫度和pH下測(cè)定酶活，使用Lineweaver-Burk[11]雙倒數(shù)法做曲線計(jì)算Km和Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆

通過序列比對(duì)，根據(jù)保守氨基酸序列，預(yù)測(cè)一段酯酶基因命名Lj0900，利用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增，將質(zhì)粒pColdⅡ和經(jīng)割膠回收的PCR目的片段進(jìn)行雙酶切，酶切后在16℃條件下過夜連接。之后把連接產(chǎn)物導(dǎo)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取形態(tài)較好的單菌落進(jìn)行菌落PCR后對(duì)其結(jié)果呈陽性克隆的轉(zhuǎn)化子接種到含Amp的LB小試管中培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒送往上海桑尼測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的目的基因序列一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。雙酶切結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切圖Fig.1 Result of use enzyme to cut recombinant plasmid

測(cè)序結(jié)果如圖2所示。

圖2 重組基因測(cè)序Fig.2 Recombinant gene sequence

2.2 重組質(zhì)粒的表達(dá)及純化

按照1.2.5節(jié)方法對(duì)重組大腸和空質(zhì)粒大腸進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)24 h后，對(duì)表達(dá)后的菌體破碎，對(duì)上清液進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證和酶活驗(yàn)證。對(duì)比發(fā)現(xiàn)重組大腸酶量得到很好的表達(dá)，并且按照1.2.7節(jié)方法，測(cè)定重組菌具有阿魏酸酯酶活性，而空質(zhì)粒菌沒有發(fā)現(xiàn)酶活。按照1.2.8節(jié)方法，重組蛋白經(jīng)HisTrapHP組氨酸標(biāo)記親和層析柱純化，收集峰位置的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證和酶活驗(yàn)證，結(jié)果顯示收集峰位置的蛋白具有阿魏酸酯酶的活性，并且呈單一的條帶，達(dá)到了下一步實(shí)驗(yàn)的要求。表達(dá)及純化結(jié)果如圖3所示。

圖3 SDS-PAGE驗(yàn)證酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化Fig.3 To verify the result of induced expression and purification by using SDS-PAGE

2.3 酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.3.1 最適溫度的測(cè)定 不同溫度下，阿魏酸酯酶的火力會(huì)有很大的影響，在以阿魏酸甲酯為底物時(shí)測(cè)定該酶在 20、30、40、50、60、70 ℃下的酶活，以最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活。從圖4中可以看出其最適溫度為30℃，在低溫下呈上升趨勢(shì)，但超過40℃時(shí)酶活急劇下降，其與方園等人[12]研究的最適溫度25℃也相差無幾。

圖4 酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of enzyme

2.3.2 最適pH的測(cè)定pH對(duì)酶催化反應(yīng)的影響也很大，pH過大（偏堿）或過?。ㄆ幔┒紩?huì)使酶失活。pH的改變能影響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離程度，同時(shí)影響底物與輔酶的解離程度，從而影響酶分子與底物分子的結(jié)合和催化。在以阿魏酸甲酯為底物時(shí)測(cè)定該酶在 pH 為 3、4、5、6、7、8、9 時(shí)的活性，發(fā)現(xiàn)在低pH下，pH越大，活性越高，在pH超過6時(shí)，活性開始下降，中性條件下活性比較高。其最適pH為6。其最適pH與方園等人[12]研究的阿魏酸酯酶基本一致。結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶的最適pHFig.5 Optimum pH of enzyme

2.3.3 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù) Km是極為重要的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，1/Km表示酶分子與底物之間親和力的大小。1/Km值越大，酶與底物的親和力越大。kcat/Km大小反映酶對(duì)底物的催化能力，值越高說明催化效率越高。分別以阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、綠原酸、咖啡酸乙酯、對(duì)羥基肉桂酸甲酯為底物，測(cè)定該酶的Km及kcat/Km值，如表1所示。發(fā)現(xiàn)以綠原酸為底物時(shí)，Km值最小，且催化效率最高，kcat/Km達(dá)到1.13×103L/（mol·s）。在以阿魏酸甲酯為底物時(shí)，其kcat/Km值高于 Topakas等[13]研究的 2.79×102L/（mol·s），但低于 Rumbold 等人[14]的 3×105L/（mol·s）。 在以綠原酸為底物時(shí)，發(fā)現(xiàn)其kcat/Km小于Lai等人[15]研究的數(shù)值。

表1 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetics parameters

3 結(jié) 語

龔燕燕等人[16]從寧佐美曲美中克隆了編碼阿魏酸酯酶A的基因，并成功在畢赤酵母中得到了異源表達(dá)。先前的研究已經(jīng)在約氏乳酸桿菌中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)阿魏酸酯酶[15]，本文根據(jù)菌株的全基因組序列和阿魏酸酯酶的保守序列又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的阿魏酸酯酶，是約氏乳酸桿菌桿菌中第三個(gè)阿魏酸酯酶。對(duì)其成功克隆表達(dá)，并具有較高的活性，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為30℃，最適pH為6。新發(fā)現(xiàn)的阿魏酸酯酶為后人進(jìn)一步研究阿魏酸酯酶奠定了一定的基礎(chǔ)。現(xiàn)在隨著分子技術(shù)的日益成熟，為FAEs找到更好的受體菌，從而實(shí)現(xiàn)更高效、高量的表達(dá)奠定了一定的基礎(chǔ)。但是，不同菌株來源的FAEs在性質(zhì)、作用等方面還是參差不齊的，況且這種酶主要是應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品等行業(yè)，更要對(duì)其安全性要求高，對(duì)此，尤其還要研究該酶的微生物安全性。所以說要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還是很難的。另一方面還可以結(jié)合微生物信息學(xué)研究其基因與酶學(xué)性質(zhì)的關(guān)系。總而言之，阿魏酸酯酶具有廣泛的應(yīng)用前景，但距離實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)還有不少的路要走，仍需要對(duì)其進(jìn)行更深的研究。