交叉引物等溫擴增檢測豬肉源性成分

馮 濤 ， 李素芳 ， 毛夢嬌 ， 邵柔銘 ， 潘家榮 *

（1.中國計量大學 浙江省海洋食品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州310018；2.中國計量大學 海洋食品加工質(zhì)量控制技術(shù)與儀器國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江 杭州310018）

肉制品摻假現(xiàn)象已成為我國食品行業(yè)重點關(guān)注的問題。諸多媒體報道，不法商販使用廉價肉類摻入或直接代替價值更高的牛羊肉進行食品加工及銷售，嚴重侵害消費者的利益。豬肉是我國食用最廣泛的肉類之一，其價格相對于牛羊肉更便宜。而信仰伊斯蘭教的穆斯林民族的飲食習慣又嚴禁豬肉源性成分的混入。肉類加工制品琳瑯滿目、種類繁多，難以通過感官進行分辨。因此對工商、食品安全部門而言，建立有效的肉類加工制品中豬源性成分的定性鑒定方法，對摻假不法行為的監(jiān)管與打擊十分必要。這有助于保證廣大消費者的健康及促進民族和諧。

核酸擴增技術(shù)[1]是有效鑒別動物源性成分的方法。高琳等利用線粒體DNA Cyt b基因PCR-RFLP技術(shù)成功鑒別豬肉和牛肉[2]，周彤等使用熒光定量PCR方法檢測肉制品中豬源性成分[3]，國外也有諸多利用PCR方法對鴨、牛、羊等動物進行物種鑒定的報道[4-6]。核酸等溫擴增技術(shù)也越來越多地應用于動物源性成分的鑒定，以LAMP為基礎的擴增方法被廣泛使用和研發(fā)[7-8]。

交 叉 引 物 等 溫 擴 增 （Crosspriming amplification，CPA）是一種新型的核酸等溫擴增技術(shù)。通過對CPA的兩條特定引物進行分子標記，使擴增產(chǎn)物成為擁有兩個特定結(jié)合位點的 “抗原”[9]。這種方法具有靈敏度高、特異性強、操作過程簡單等優(yōu)點，已經(jīng)被大量用于檢測細菌、病毒、病原體等[10-13]。但在動植物鑒定方面還少有報道，因此CPA-核酸試紙條檢測技術(shù)在食品摻假方面具有研究和使用前景。

mtDNA是高等動物的核外遺傳物質(zhì)，單細胞中含有多個線粒體，線粒體中，基因的數(shù)量少，基因拷貝數(shù)多，且具有種內(nèi)和種間多態(tài)性[14-15]，拷貝數(shù)大。而細胞核DNA中基因的數(shù)量龐大，單拷貝的基因居多，在深加工肉制品[16]中單拷貝的基因更容易丟失。因此mtDNA較細胞核DNA更適合作用檢測目標。本研究在分析牛、羊、豬、鴨、雞線粒體DNA D-loop基因[17]序列的基礎上，設計用于肉制品中豬源性成分檢測的CPA引物體系，擬建立豬源性成分定性檢測的交叉引物等溫擴增-核酸試紙條檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所使用的動物樣本（牛、羊、雞、鴨、豬）購自杭州大型超市；實驗用引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；核酸試紙條購自杭州尤思達生物技術(shù)有限公司。

實驗所用核酸試紙條為膠體金免疫試紙條，其中加樣區(qū)包含膠體金-親和素復合物，檢測線（T線）包埋熒光素的抗體，質(zhì)控線（C線）包埋生物素。使用時，用移液器吸取10 μL的擴增產(chǎn)物滴入試紙條加樣區(qū)，將試紙條插入2×SSC緩沖液中進行檢測。

1.2 儀器和設備

PCR擴增儀、Nanodrop-2000電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 總DNA的制備

用DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，方法參照使用手冊。將制備好的DNA用ND-2000核酸蛋白分析儀檢測，并將其質(zhì)量濃度調(diào)整為約100 ng/μL。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因比對和CPA引物設計

在 GenBank上整理鴨、牛、羊、雞、豬線粒體DNA D-loop基因的序列。同種動物不同個體之間的D-loop基因存在一定水平的遺傳多樣性，在CPA引物設計中需要考慮到這種差異。故通過比對GenBank上已公布的豬D-loop基因序列，在CPA引物設計時盡量避開突變位點，以保證CPA系統(tǒng)的通用性和有效性。對豬源D-loop基因上特異性片段序列設計CPA引物組并實驗篩選。

1.5 CPA引物與探針的篩選及體系優(yōu)化

1.5.1 引物與探針的篩選 對1.4節(jié)中設計的CPA引物組進行初步篩選，將1.3節(jié)中提取的豬DNA作為陽性對照，將提取的牛、羊、鴨、雞4種常見畜禽肉的總DNA以及無菌水作為陰性對照，所有DNA模板均使用ddH2O稀釋至100 ng/μL。篩選反應體系見表1，反應溫度預設63℃，反應60 min。擴增結(jié)束，取10 μL擴增產(chǎn)物用核酸電泳和試紙條分別進行檢測。

表1 20 μL CPA初始反應體系Table 1 20 μL CPA initial reaction system

1.5.2 引物與探針濃度的優(yōu)化 以CPA反應體系中的交叉引物2a1s和探針（2a/3a）的質(zhì)量濃度作為變量，設計引物質(zhì)量濃度交叉實驗。在研究中發(fā)現(xiàn)當交叉引物2a1s質(zhì)量濃度≥探針2a/3a質(zhì)量濃度時擴增效果較好，設計18組質(zhì)量濃度配比實驗（見表2），每個實驗組中設立3個平行陰性實驗（以無菌水為模板）和3個平行陽性實驗（以100 ng/μL豬的總DNA為模板）。

表2 CPA引物濃度交叉實驗設計Table 2 Concentration cross experiment of CPA primers

1.5.3 引物體系的特異性及穩(wěn)定性實驗 對1.5.2節(jié)中擴增結(jié)果理想的引物濃度組合，以豬的總DNA作為陽性對照，以牛、羊、鴨、雞的總DNA以及無菌水作為陰性對照，進行CPA擴增引物特異性實驗。反應產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳和核酸試紙條進行檢測，比較結(jié)果。

對特異性良好的實驗組，后續(xù)進行穩(wěn)定性實驗。設立3個重復組，每個重復組分別設立6個平行陰性實驗和6個平行陽性實驗?？傆?8個陰性實驗及18個陽性實驗結(jié)果均正確的實驗組為本次研究的最佳引物體系。

1.6 CPA擴增靈敏度實驗

將保存的豬DNA樣品梯度稀釋（10倍稀釋）成100、10、1、1×10-1ng/μL。 用 1.5 節(jié)中篩選優(yōu)化的CPA反應體系進行擴增靈敏度實驗。反應產(chǎn)物用電泳和試紙條分別進行檢測，以確定CPA反應體系對單一成分豬肉DNA的靈敏度。

1.7 混合肉中豬肉成分的檢測

將豬肉按比例 （50% 、20%、10%、5%、1% 、0%）與牛肉進行混合，用SDS動物組織DNA提取方法[18-19]提取總DNA，并將混合DNA質(zhì)量濃度調(diào)整至100 ng/μL，作為模板進行CPA擴增，產(chǎn)物使用核酸試紙條進行檢測，研究肉類混合對檢出限的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性片段序列及CPA引物

1.4節(jié)中設計的CPA引物組，經(jīng)過1.5節(jié)實驗篩選后最終的引物組合見表3。圖1為設計引物所使用的特異性片段序列，同時各引物在序列上對應的位置也如圖1所示。比較圖中牛、羊、豬的片段序列可以發(fā)現(xiàn)，本引物系統(tǒng)的特異性主要體現(xiàn)在引物Sus Dlp 2s1a的3端。

表3 豬源檢測CPA系統(tǒng)引物表Table 3 Nucleotide sequences of the primers of Sus CPA

表4為通過1.5節(jié)篩選及反應體系優(yōu)化后確定的最佳反應體系。

2.2 CPA擴增特異性實驗結(jié)果

以鴨、羊、牛、豬、雞DNA為模板按表4最佳反應條件進行CPA擴增實驗，電泳結(jié)果如圖2所示。以水為模板的陰性對照電泳圖中無擴增產(chǎn)物，說明引物間不發(fā)生擴增反應；以豬DNA為模板的CPA擴增產(chǎn)物在電泳下檢測出階梯狀核酸條帶，在100 bp左右位置出現(xiàn)兩條清晰的電泳條帶，此為CPA擴增的特征條帶，條帶的位置根據(jù)引物設計位置不同有所差異；以羊、牛、鴨、雞DNA為模板的擴增實驗中，產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示有核酸片段產(chǎn)物（彌散亮帶），但無CPA特征條帶。在2.1節(jié)中已指出，本引物組合的特異性主要體現(xiàn)在引物Sus Dlp 2s1a上，其他4條引物不具有高特異性，只作為CPA必要引物存在。在擴增實驗中這4條引物也能以羊、牛、鴨、雞DNA為模板進行擴增反應。但在缺少引物Sus Dlp 2s1a的擴增產(chǎn)物前提下，羊、牛、鴨、雞DNA擴增產(chǎn)物與豬DNA擴增結(jié)果不同。結(jié)果表明本引物系統(tǒng)具有良好的特異性，只對豬源性成分具有完整的CPA擴增，其他模板只能進行部分擴增反應。

圖1 豬線粒體D-loop基因中目標片段及引物位置Fig.1 Nucleotide sequence alignment of the target regions of D-loop gene in pork mtDNA.Arrows indicate the primers used for CPA assays

表4 20 μL CPA最佳反應體系Table 4 20 μL CPA best reaction system

核酸試紙條檢測結(jié)果（圖3）中只有豬DNA對應的試紙條上檢測線顯示為紅色，其他模板對應的試紙條上檢測線不顯示紅色。核酸試紙條檢測結(jié)果與電泳結(jié)果一致，核酸試紙條能對豬DNA的CPA擴增產(chǎn)物正確檢測。在120 V電壓下，電泳系統(tǒng)工作30～40 min后呈現(xiàn)的電泳條帶最為理想，而使用核酸試紙條檢測，只需3～5 min即可完成加樣到最終的結(jié)果觀察的過程。

圖2 豬源CPA系統(tǒng)擴增特異性電泳圖Fig.2 Analysis of pork DNA by CPA with agarose gel electrophoresis

N-空白對照；S-豬模板；B-牛模板；O-羊模板；G-雞模板；A-鴨模板

2.3 CPA擴增靈敏度

CPA反應體系對單一成分豬DNA檢測的靈敏度實驗結(jié)果如圖4所示，模板質(zhì)量濃度為100、10、1 ng/μL時，核酸試紙條檢測結(jié)果為陽性。實驗結(jié)果表明在研究設計并優(yōu)化的CPA反應體系下，質(zhì)量濃度大于等于1 ng/μL的豬DNA模板能被準確識別并進行擴增，電泳條帶及試紙條檢測結(jié)果明顯一致。當模板質(zhì)量濃度小于1 ng/μL時，本系統(tǒng)不能準確進行檢測。

圖4 豬源CPA系統(tǒng)梯度稀釋模板擴增產(chǎn)物試紙條檢測結(jié)果Fig.4 Nucleic acid strip test of CPA products targeting the plasmid with different folds

2.4 混合肉中豬肉成分檢測結(jié)果

混合肉中不同豬肉比例的CPA檢測結(jié)果見圖5及表5。表5中當豬肉含量在10%以上時，CPA擴增方法能夠準確地檢測出樣品中的豬源性成分；當豬肉成分比例在10%以下時，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，表現(xiàn)為檢測線顏色很淺或不限色，如圖5中試紙條4的檢測線存在少量紅色，說明擴增產(chǎn)物中有雙標記的CPA產(chǎn)物但產(chǎn)量極低。在不考慮取樣誤差的前提下，100 ng/μL的 10%混合樣品DNA提取液中豬DNA的質(zhì)量濃度為10 ng/μL，即當檢測樣品中豬DNA的質(zhì)量濃度大于等于10 ng/μL時本方法可以檢測出混合樣品中的豬源性成分。比較1.6與1.7節(jié)的實驗結(jié)果，混合肉中豬肉成分的檢出限（10 ng/μL）要低于單豬肉成分的檢出限（1 ng/μL），相差約為一個數(shù)量級（10倍）。相關(guān)的動物源性成分檢測研究報道中，混合制品的檢出限一般在10%以下，楊冬燕等在多重熒光PCR鑒定羊肉摻假實驗中，準確檢測出最低摻假比例為7%的樣品[20]；周如華等借助實時熒光定量PCR檢測羊肉制品中鼠源性成分的檢測限則為1%[21]。這是由于本研究中設計的CPA引物中部分引物具有通用性，混合肉中的其他肉成分DNA能與這部分引物進行反應，與豬DNA競爭性反應消耗引物。競爭性消耗在豬DNA含量越低時越明顯。在本團隊研究的鴨源成分CPA檢測研究中混合制品的檢出限達到1%（未發(fā)表）。因此，豬源CPA反應體系仍存在改進空間，檢測靈敏度需進一步提高。

圖5 混合肉中不同比例豬肉成分的檢出限Fig.5 Limit of detection in different ratio meat mixtures

表5 不同比例混合豬肉的CPA檢測結(jié)果（n=3）Table 5 Results of CPA of pork meat mixtures（n=3）

3 結(jié) 語

本研究建立了豬源性交叉引物等溫擴增-核酸試紙條方法。該方法與鴨、羊、牛、豬、雞無交叉反應，具有檢測特異性，能夠正確檢測出樣品中是否含有豬源性成分。對于單一豬肉源樣品，檢出限可以達到1 ng/μL。對混合肉制品中豬源成分占10%時，相當于豬DNA質(zhì)量濃度大于10 ng/μL時使用本方法可以穩(wěn)定地檢出。本方法仍有較大的改進空間。