間充質(zhì)干細胞源外泌體治療類風濕性關節(jié)炎動物模型和臨床研究進展

王思捷，廖淑珍，招春飛，吳 平*，潘慶軍*

(1. 廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 湛江 524001；2. 湛江市慢性腎臟病防控重點實驗室，廣東 湛江 524001)

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)是指機體對自身抗原產(chǎn)生免疫反應，進而導致自身組織損害所引起的疾病。其中，類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)較常見。RA的常見病理改變?yōu)殛P節(jié)的腫脹、滑膜關節(jié)的破壞和慢性炎癥[1- 2]，并高表達多種炎癥因子，如白細胞介素27(interleukin 27，IL-27)、白細胞介素35(IL-35)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等促炎因子已被證實與RA的發(fā)病有關[3- 4]。目前，其臨床治療可選的藥物有限，治療效果仍不容樂觀。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)指具有多譜系分化能力潛能的細胞，近年來，其在自身免疫性疾病發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)功能備受關注[5]。外泌體(exosomes，Exos)是一類直徑約30至150納米的細胞外囊泡，由細胞內(nèi)部的胞內(nèi)體與細胞膜融合釋放到細胞外形成[6]，其內(nèi)富含蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等物質(zhì)，作為細胞間傳遞信息的載體，可發(fā)揮多種生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞可排泌多中外泌體[7]，其對RA可能具有潛在的治療作用，本文對此作一綜述。

1 間充質(zhì)干細胞與類風濕性關節(jié)炎

MSCs可對參與先天性和適應性免疫應答的多種細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。自體MSCs可通過IFN-γ、TNF-α、IL-1α或β等促炎性細胞因子顯著抑制活化的淋巴細胞的增殖[8]。已報道從健康受試者中提取的滑膜間充質(zhì)干細胞(synovial MSCs，S- MSCs)能夠在體外抑制混合淋巴細胞反應中的T細胞的增殖[9]。機制方面，MSCs對T細胞的作用包括抑制CD4+T細胞在對有絲分裂原或抗體(抗CD2 /CD3/ CD28)活化反應中的增殖[10-12]。此外，MSCs還能抑制T細胞分泌IL-2、TNF-α等炎癥因子[13]。

MSCs治療RA具有潛在的療效，但也存在一定的問題。基于患者自體MSCs的數(shù)量和功能的缺陷，同種異體的MSCs治療方案表現(xiàn)出來更大的優(yōu)勢。RA的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，同種異體的MSCs在體外表現(xiàn)出較差的免疫原性[14]。在膠原誘導的關節(jié)炎動物模型(collagen induced arthritis，CIA)中發(fā)現(xiàn)，腹腔注射同種異體MSCs反應良好[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，給RA患者靜脈輸注同種異體的MSCs或臍帶來源的MSCs，抗TNF的耐藥患者會出現(xiàn)短暫的臨床改善[16]，同種異體的MSCs在RA治療中具有安全性和潛在的有效性[17]。除單獨輸注MSCs外，同種異體的MSCs與常規(guī)藥物相結(jié)合的治療方法，可使RA的患者在臨床指標和血清學上得到顯著的改善[18]。另對15例難治性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者的治療發(fā)現(xiàn)，同種異體的MSCs治療后，患者的腎功能得到穩(wěn)定的改善[18]。另一方面，同種異體的MSCs治療RA 也存在一定的面問題。有報道發(fā)現(xiàn)， CIA動物模型在注射使用MSCs后，所有動物的跖趾關節(jié)和趾間關節(jié)都出現(xiàn)了明顯的關節(jié)炎癥狀[19]。 此外，由于MSCs可以抑制抗腫瘤免疫反應，存在的隱性或低活性的腫瘤可能被激活的風險[20]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，局部的MSCs輸注治療，如關節(jié)內(nèi)注射MSCs，一定程度上可能降低風險并獲益。一項SCID小鼠關節(jié)炎模型的研究發(fā)現(xiàn)關節(jié)內(nèi)注射脂肪組織來源的MSCs治療風濕性疾病，具有實用性和安全性[21]。但在RA的臨床病例研究中，關節(jié)內(nèi)注射MSCs作為治療手段，仍需要更多實驗與評估。

2 外泌體與類風濕性關節(jié)炎

當前，外泌體參與RA發(fā)病已被認知。在RA患者的成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)中可分離到含TNF-α的外泌體，TNF-α可激活NF-κB，進一步可誘導滑膜組織中T細胞的抗凋亡機制，進而加重炎癥反應[22]。FLSs來源的攜帶CD13的外泌體可誘導T細胞的趨化作用，進一步激活RA中的FLS增生，并釋放多種致炎因子，進而加速RA炎癥進程[23]。研究顯示，Wnt信號通路在RA造成的骨侵襲、骨質(zhì)疏松等改變中發(fā)揮著重要作用[24]。而外泌體也參與了Wnt信號通路的調(diào)控，CD9和CD82可通過外泌體分泌形式，將Wnt通路下游分子β-catenin外排到胞外，從而降低自身Wnt信號通路活性[24]。同時，腫瘤細胞也可通過外泌體介導的方式，將14-3-3蛋白和β-catenin轉(zhuǎn)移至下游靶細胞，激活其Wnt信號通路[25]。FLS來源的外泌體中的miR-221-3p可影響成骨細胞分化，而在 RA 模型中，TNF可促進miR-221-3p的表達，上調(diào)的miR-221-3p通過抑制Wnt信號通路中的Dkk，最終可阻滯成骨細胞的分化，影響磨損骨質(zhì)的修復進程[26]。RA病人的關節(jié)液和滑膜組織中可分離到含miR-let-7b的外泌體，而miR-let-7b可激活Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)，進而促進M1巨噬細胞的增值分化，加重RA的炎癥反應[27]。RA的動物模型研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制基因修飾的骨髓來源樹突狀細胞(dendritic cells，DC)的外泌體，可抑制CIA動物模型中關節(jié)炎的嚴重程度和發(fā)生率[28]。而經(jīng)白細胞介素10(IL-10)處理的DC來源的外泌體則可抑制CIA動物模型的關節(jié)炎的發(fā)病，并減輕已發(fā)病的動物模型的關節(jié)炎嚴重程度[29]。綜上，外泌體參與了RA發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。

3 間充質(zhì)干細胞源的外泌體與類風濕性關節(jié)炎

MSCs-Exos除攜帶結(jié)構蛋白(細胞膜骨架蛋白、微管蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白等)外，還攜帶多種功能性蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82、Hspa8、Hsp60、Hsp70和Hsp90、ALG-2相互作用蛋白X與腫瘤易感基因101蛋白，代謝相關蛋白GAPDH、LDHA、PGK1和PKM，以及特異性的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ等)[30]。除蛋白質(zhì)外，MSCs-Exos還能轉(zhuǎn)運多種RNA(mRNA、miRNA和siRNA等)，其中mRNA可直接在靶細胞中翻譯出相應的功能蛋白質(zhì)，發(fā)揮再生修復等作用；miRNA 則通過沉默或抑制目標mRNA翻譯，從而下調(diào)蛋白質(zhì)在靶細胞中的表達；siRNA則可敲除受體細胞中的目標基因達到基因沉默的作用[31]。

體外實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exos可通過減少T、B淋巴細胞的增殖，在炎癥性關節(jié)炎誘導Treg細胞群來發(fā)揮免疫抑制作用[32]。動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exos可以減輕骨性關節(jié)炎動物的骨關節(jié)炎癥狀[33]。已報道，軟骨細胞可在密閉的、處于低氧環(huán)境的關節(jié)腔內(nèi)，正常新陳代謝，但極低氧環(huán)境可促進促炎因子(IL-1、IL-6和MCP-1等)及趨化因子(CXCL-12、COX-2、血管內(nèi)皮生長因子和前列腺素E2)等生成，誘發(fā)微環(huán)境中慢性炎癥反應、軟骨下骨硬化與骨贅形成[34]。已報道，這些骨性關節(jié)病理微環(huán)境的改變與局部外泌體所攜帶的多種蛋白和RNA轉(zhuǎn)運密切相關[35]。另外，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP)可介導細胞外基質(zhì)的降解，炎癥因子穿透軟骨表面可導致RA炎癥滑膜局部浸潤[36]。攜帶miRNA-150-5p的MSCs-Exos可顯著下調(diào)了MMP14和血管內(nèi)皮生長因子的表達，減輕了關節(jié)炎的嚴重程度[37]。

綜上，在RA中，MSCs-Exos不但具備MSCs的治療效果，且降低了MSCs的潛在治療風險，有望為RA的治療提供新的策略，但仍需更多的動物模型和臨床研究。

4 展望

近年來，MSC治療RA的研究取得一定的進展，但在動物及臨床病例研究中顯示其存在一定的治療風險。但MSCs排泌的功能性Exos不但具備MSCs的療效，且降低了MSCs的潛在治療風險。然而，這一新療法仍有一些問題急需解決：(1)如何獲取大量的可用于治療的外泌體；(2)需開發(fā)高效的外泌體的分離及純化的技術方法；(3)外泌體組成成分復雜，需進一步研究各效應成分的作用機制。隨著Exos研究技術的成熟，以及更多的動物模型和大規(guī)模的臨床研究，MSCs-Exos有望為RA的治療提供新的策略。