響應(yīng)面法優(yōu)化杭白菊花精油的提取工藝及其化學(xué)成分研究

沈懋文，邵亮亮，侯付景，樊艷鳳，管永芳，蘇秀榕*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

響應(yīng)面法優(yōu)化杭白菊花精油的提取工藝及其化學(xué)成分研究

沈懋文，邵亮亮，侯付景，樊艷鳳，管永芳，蘇秀榕*

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

為了綜合利用杭白菊花精油，對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用超臨界CO2流體萃取技術(shù)，響應(yīng)面法優(yōu)化萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間對(duì)杭白菊精油提取率的影響，以確定超臨界CO2萃取杭白菊精油的最優(yōu)條件；利用模型的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，對(duì)影響超臨界CO2萃取杭白菊精油提取率的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為萃取壓力25MPa、萃取溫度74.9℃、萃取時(shí)間186.3min時(shí)，萃取效果最佳，理論提取率為3.51%；實(shí)際提取率為3.464%，比理論值低1.28%。氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析，鑒定出44種化合物，應(yīng)用面積歸一化法測(cè)定各成分的相對(duì)百分含量。已鑒定化合物組分占總提取物的72.3%，其中有20種相對(duì)百分含量大于1%。

超臨界萃取；響應(yīng)面；杭白菊花精油；化學(xué)成分

Abstract：The optimal conditions (namely extraction pressure, temperature and time) for the supercritical CO2extraction of volatile oil from the flowers of Chrysanthemum morifolium were investigated using response surface methodology (RSM) based on a 3-variable, 3-level Box-Benhnken experimental design leading to 15 experiments. Meanwhile, the extracted volatile oil was analyzed for chemical composition. Computer generated response surfaces, canonical analysis and contour plot interpretation revealed that the optimal values of extraction pressure, temperature and time were 25 MPa, 74.9 ℃ and 186.3 min, respectively.Under such conditions, the experimental and predicted values of volatile oil yield was 3.464% and 3.51% and the former was 1.28% lower than the latter. Totally 44 compounds were identified by GC analysis in the extracted volatile oil and their total content was determined by the area normalization method to be 72.3%, of which, 20 exhibited a relative content of more than 1%.

Key words：supercritical CO2extraction；response surface methodology；volatile oil from the flowers of Chrysanthemum morifolium；chemical composition

精油也稱揮發(fā)油，是存在于植物體中的一類具有芳香氣味，在常溫下能揮發(fā)，可隨水蒸氣蒸餾出來的油狀液體的總稱。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，植物精油在去痛、降壓、消炎、提高免疫活力、保健、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等方面得到了廣泛的應(yīng)用。在化妝品方面，植物精油被廣泛應(yīng)用于香水、香皂、洗面奶、護(hù)膚品等各種化妝品的制造。此外，植物精油在飼料和食品添加劑、防止蟲害等方面也有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。我國的自然條件適合于各種天然香料植物的生長(zhǎng)，蘊(yùn)藏著極為豐富的天然香料資源，是發(fā)展天然香料的有利條件。含精油較為豐富的植物科屬有松柏科、木蘭科、樟科、蕓香科、傘形科、唇形科、姜科、菊科、金娘科、龍樟香科、禾本科等[3]。杭白菊(Chrysanthemum morifolium)是浙江省八大名藥材“浙八味”之一。因其優(yōu)良的治病保健、延年益壽功效而馳名中外，并載入歷代諸家本草，被人們親切地冠以“延壽客”的嘉名[4-5]。精油的傳統(tǒng)提取方法主要有有機(jī)溶劑萃取法、水蒸氣蒸餾法，存在萃取率低、溶劑殘留、產(chǎn)物香型變化、香氣強(qiáng)度低等缺點(diǎn)[6]。而二氧化碳超臨界萃取可以在常溫下進(jìn)行，無毒、無殘留，而且香型逼真、香氣強(qiáng)度高[7-8]。本研究在單因素的基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面確定影響杭白菊精油提取率的主要因素及其相互關(guān)系，并擬合得到回歸方程，優(yōu)選出最佳工藝條件，為工業(yè)生產(chǎn)開發(fā)提供有價(jià)值的工藝參數(shù)[9]，并利用氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)精油的成分進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

杭白菊取于浙江桐鄉(xiāng)產(chǎn)的東方牌杭白菊。

CO2(純度99.5%以上) 寧波方馨氣體有限公司；化學(xué)試劑(均為分析純) 寧波博奧化學(xué)試劑有限公司。SpeedTMSFE-2型二氧化碳超臨界流體萃取儀 美國Applied Seperations公司。

1.2 方法

1.2.1 菊花預(yù)處理

將杭白菊于50℃干燥3h，用高速藥物粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，稱取20g粉末待用。

1.2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

利用二氧化碳超臨界流體萃取儀，以壓力、溫度和時(shí)間因素，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用響應(yīng)面法在三因素三水平上對(duì)杭白菊精油的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平表Table 1 vairables and levels in Box-Benhnken experimental design

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS8.0和EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 GC-MS分析杭白菊精油

色譜條件：毛細(xì)管柱：(30m×0.25mm，0.25μm)；高純氦氣，柱流量為1.0mL/min；分流進(jìn)樣，分流比50:1；進(jìn)樣量0.5μL；柱溫：起始溫度50℃，保持2min；以5℃/min升至260℃，保持5min。

質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離電壓70eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接溫度280℃，電子倍增器電壓1340V，掃描質(zhì)量范圍50～550u，溶劑延遲2.0min。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件

表2 杭白菊精油萃取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken experimental design matrix and corresponding experimental values of volatile oil yield

表2中，試驗(yàn)1～12為析因試驗(yàn)，13～15為中心試驗(yàn)。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn), 零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

采用Design-Expert 7.1.3 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，分析結(jié)果見表3。3個(gè)因素經(jīng)過擬合得到的二次多元回歸方程為：

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance for volatile oil yield with various extraction conditions

從表3的方差分析可見，二次多項(xiàng)式模型的F值為13.45，P值為0.0053＜0.05，說明用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，因其變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著，即這種試驗(yàn)方法是可靠的。相關(guān)系數(shù)R2=0.9697，說明杭白菊精油提取率的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度。由回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還可以看出方程的失擬項(xiàng)很小，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況好，誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。從回歸方程各項(xiàng)方差的進(jìn)一步檢驗(yàn)也可看出，一次項(xiàng)中極顯著的因素為X1，影響顯著因素為X3。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序：X1＞X3＞X2，即萃取壓力＞萃取時(shí)間＞萃取溫度。3個(gè)因素中，壓力和溫度之間存在較為顯著的交互作用。

2.2 等高線圖和響應(yīng)面分析

圖1 萃取溫度和萃取壓力對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Reponses surface plot and contour plot showing the interactive effects of extraction temperature and pressure on volatile oil yield

圖1直觀地給出了萃取溫度和萃取壓力交互作用的響應(yīng)面圖和等高線分析圖。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。從其等高線圖可以直觀的看出兩因素的交互作用顯著，等高線沿壓力軸變化相對(duì)密集，說明萃取壓力對(duì)響應(yīng)峰值的影響比溫度大。在低壓條件下，隨著萃取溫度的升高，提取率反而先升后降；而在高壓條件下，提取率基本呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度過高后才開始下降。呈現(xiàn)這一規(guī)律的原因在于：超臨界CO2萃取杭白菊精油的溶解能力主要決定于CO2流體密度，而萃取壓力與萃取溫度的改變是CO2流體密度變化的主要決定因素，隨著萃取壓力和溫度的增加，CO2流體密度逐漸增加，CO2溶解能力增加，使得提取率有所增加；當(dāng)萃取壓力較低時(shí)，升溫能夠引起溶質(zhì)揮發(fā)性增加，但不足以抵消CO2溶解杭白菊精油能力的降低，總的結(jié)果是溶劑相中精油的提取率減少。

圖2 萃取時(shí)間和萃取壓力對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Reponses surface plot and contour plot showing the interactive effects of extraction time and pressure on volatile oil yield

由圖2可知，壓力與時(shí)間對(duì)提取率的交互影響不太顯著，在壓力與時(shí)間的交互作用等高線圖中，沿壓力軸方向的等高線密度變化明顯高于時(shí)間方向的變化，說明在時(shí)間和壓力的相互作用中，壓力對(duì)杭白菊精油提取率的影響要大于時(shí)間。隨著萃取壓力的增加，精油的提取率是逐步增大的。這主要是因?yàn)檩腿毫υ黾訒r(shí)，分子間平均間隙減小，溶質(zhì)與溶劑間的親和性增強(qiáng)，從而增加了溶劑的擴(kuò)散與滲透能力，提高了超臨界CO2的溶解能力。

圖3 萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Reponses surface plot and contour plot showing the interactive effects of extraction time and temperature on volatile oil yield

圖3表明等高線密度沿時(shí)間軸方向略大于溫度方向，說明在時(shí)間和溫度的相互作用中，時(shí)間對(duì)杭白菊精油提取率的影響要大于溫度。時(shí)間和溫度編碼值較大部分的響應(yīng)值有減小趨勢(shì)，可能是因?yàn)榫褪菬崦粜晕镔|(zhì)，過高的溫度會(huì)破壞它的成分。而提取率隨時(shí)間上升到某一數(shù)值時(shí)就不會(huì)再增加。由Design-Expert軟件分析得到的最大響應(yīng)值(Y)時(shí)對(duì)應(yīng)的編碼值分別為X1=1、X2=0.49、X3=0.21，與之相應(yīng)的超臨界CO2萃取杭白菊精油的最佳條件為萃取壓力25MPa、萃取溫度74.9℃、萃取時(shí)間186.3min，理論最佳提取率為3.51%。

表4 杭白菊的超臨界萃取精油的化學(xué)成分Table 4 Chemical composition of volatile oil from the flowers of Chrysanthemum morifolium

為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，采用得到的最佳提取條件進(jìn)行杭白菊精油的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。3次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際平均提取率為3.464%，與理論值相差1.28%。因此，響應(yīng)面法對(duì)杭白菊精油提取條件的優(yōu)化是可行的，得到的精油提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 GC-MS結(jié)果分析

對(duì)提取出的杭白菊精油進(jìn)行氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀的分析，經(jīng)過計(jì)算機(jī)譜庫檢索，查對(duì)有關(guān)質(zhì)譜資料，分別對(duì)色譜峰加以確認(rèn)，綜合分析鑒定出以下化學(xué)成分，并按面積歸一化法確定各組分相對(duì)百分比含量。由表4可以看出，利用響應(yīng)面優(yōu)化的最佳超臨界萃取工藝提取的杭白菊精油，53種化合物，鑒定出了44種，已鑒定化合物組分占總提取物的72.3%，其中有20種相對(duì)百分含量大于1%。

3 結(jié) 論

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)，可同時(shí)考慮幾種因素，尋求最佳因素水平組合，但它不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，即多項(xiàng)式回歸方程，從而無法找到整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析方法是通過中心組合試驗(yàn)研究幾種試驗(yàn)因素間交互作用的一種回歸分析方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)，并從圖形方面分析尋求最優(yōu)試驗(yàn)考察因素值。目前已經(jīng)在蛋白水解工藝上已經(jīng)廣泛使用[10]。本研究將響應(yīng)面優(yōu)化和超臨界CO2萃取結(jié)合，模擬得到多項(xiàng)式回歸方程，很直觀的掌握各因素對(duì)杭白菊精油提取率的影響程度：萃取壓力＞萃取時(shí)間＞萃取溫度。確定了萃取時(shí)間對(duì)提取工藝有顯著影響，萃取溫度對(duì)提取工藝無顯著性作用。經(jīng)過方差分析得到最佳工藝參數(shù)為萃取壓力25MPa、萃取溫度74.9℃、萃取時(shí)間186.3min，精油提取率3.51%。這與傳統(tǒng)提取方法相比，萃取時(shí)間短，節(jié)約能耗，無有機(jī)溶劑污染，提取率高[6,11]。

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀分析鑒定的杭白菊精油44種化合物中，主要成分為烯類、倍半菇烯類及其含氧衍生物等。這些化合物是存在于植物界的常見化合物，其生物活性是多方面的，并且是某些中藥的主要有效成分，這對(duì)今后開發(fā)利用杭白菊成為保健食品及綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 瞿新華. 植物精油的提取與分離技術(shù)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(32):194-195.

[2] 孫鵬, 劉文文. 植物精油提取和應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 甘肅科技, 2007,23(5): 139-141.

[3] 回瑞華, 侯冬巖, 李鐵純, 等. 千山野菊花揮發(fā)性化學(xué)成分的提取與分析[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊(cè), 2006, 42(8): 640-643.

[4] 慕運(yùn)動(dòng). 響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 22(3): 91-94.

[5] 王永菲, 王成國. 響應(yīng)面法的理論與應(yīng)用[J]. 中央民族大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2005, 14(3): 236-239.

[6] RAMAIAH S, BALARAMAN M, SOUNDAR D. Synthesis of vanillylmahoside using glucosidases by response surface methodology[J]. Eur Food Res Technol, 2007, 226(1/2): 255-263.

[7] YAN Youchun, BORNSCHEUER U T, STADLER G, et a1. Production of sugar fatty acid estrs by enzymatic esterificationinastirred-tank membranereactor: optimization of parameters by response surface methodology[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 2001,78(2): l147-1153．

[8] 殷紅, 揚(yáng)鑫驥, 盛靜, 等. 不同情況下杭白菊中揮發(fā)油成分的分析[J].藥物鑒定, 2004, 13(2): 46.

[9] 楊秀偉, 韓美華, 陶海燕, 等. 微波加工和蒸制杭白菊揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J]. 中國中藥雜志, 2007, 32(3): 226-231.

[10] HU Xiaobo, RUAN Zheng, XUE Zhaohui, et al. Preparation of peptides hydrolyzed from rape pollen glutelin[J]. Transactions of the CSAE農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(5): 240-244.

[11] 翁少偉, 陳建華, 黃少烈, 等. 超臨界CO2萃取及分子蒸餾技術(shù)聯(lián)用提取分離杭白菊精油[J]. 醫(yī)藥食品化工, 2008, 35(4): 68-72.

Response Surface Methodology as an Approach to Optimization of Supercritical CO2Extraction and Chemical Composition Analysis of Volatile Oil from Flowers of Chrysanthemum morifolium

SHEN Mao-wen，SHAO Liang-liang，HOU Fu-jing，F(xiàn)AN Yan-feng，GUAN Yong-fang，SU Xiu-rong*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)10-0101-04

2009-09-15

浙江省回國人才基金資助項(xiàng)目

沈懋文(1985—)，女，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ獭-mail：shenmaowen@nbu.edu.cn

*通信作者：蘇秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程和生化與分子生物學(xué)。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn