豬定時(shí)輸精技術(shù)研究進(jìn)展

郭曉飛，張金龍，李義海，田見暉，李俊杰，翁士喬，張效生*

（1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071001；4.寧波三生藥業(yè)有限公司，浙江寧波 315100）

人工授精技術(shù)可以提高優(yōu)秀公豬的利用效率，同期發(fā)情技術(shù)則可以提升母豬群的繁殖水平。1949 年，威斯康星大學(xué)的Tanabe 等[1]利用綿羊的垂體提取物對經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬進(jìn)行注射后，報(bào)道了較早的母豬同期發(fā)情和人工授精技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用的效果，即逐步產(chǎn)生了母豬定時(shí)輸精技術(shù)。1990 年，擁有110 萬頭母豬群的東德將定時(shí)輸精管理操作技術(shù)運(yùn)用于其86%的母豬生產(chǎn)中，標(biāo)志著該技術(shù)大規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用的成熟[2]。經(jīng)過幾十年的研發(fā)應(yīng)用，定時(shí)輸精技術(shù)已在歐美各國被廣泛應(yīng)用[3]。經(jīng)過于2016 年成立的全國母豬定時(shí)輸精技術(shù)研究和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用協(xié)作組的推動(dòng)，我國大型養(yǎng)豬場已開始逐步實(shí)現(xiàn)定時(shí)輸精的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用[2]。

在養(yǎng)殖企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中，有10%～30%的后備母豬存在隱性發(fā)情，由于沒有被觀測到明顯的發(fā)情表征而被耽誤生產(chǎn)時(shí)間；有9%～21%的初產(chǎn)母豬在斷奶后遲遲未顯現(xiàn)發(fā)情特征而遭到淘汰；即便是經(jīng)產(chǎn)母豬，在斷奶7 d內(nèi)的發(fā)情率也僅在75%～85%[2]。然而，以上隱性發(fā)情的母豬群體大部分均能照常排卵。通過定時(shí)輸精技術(shù)可以促進(jìn)母豬發(fā)情，增加母豬年產(chǎn)胎次數(shù)，減少母豬的非生產(chǎn)天數(shù)，從而提高母豬的生產(chǎn)利用效率[4]。因此，定時(shí)輸精是未來規(guī)?；i養(yǎng)殖場實(shí)現(xiàn)母豬高效利用的重要繁殖生產(chǎn)技術(shù)。本研究主要對豬定時(shí)輸精技術(shù)的發(fā)展歷程、技術(shù)原理以及幾種生殖激素的使用和輸精方案的實(shí)施做一綜述，為豬定時(shí)輸精技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 豬定時(shí)輸精技術(shù)原理

母豬的發(fā)情與排卵過程是由促性腺激素釋放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）、促卵泡素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（Luteotropic Hormone，LH）、雌激素（Estrogenic Hormone，E2）、孕酮（Progesterone，P4）和催乳素（Prolactin，PRL）等激素的共同調(diào)節(jié)作用下完成。例如，經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶后，由于失去仔豬對乳頭和乳房的刺激，血液中PRL 水平迅速下降，導(dǎo)致下丘腦分泌GnRH 水平重新上升，進(jìn)而刺激腺垂體釋放FSH 和少量LH 以促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟；發(fā)育的卵泡產(chǎn)生E2促使母豬外部表現(xiàn)發(fā)情，當(dāng)E2分泌至一定水平時(shí)，抑制FSH 分泌同時(shí)引發(fā)LH 峰，最終導(dǎo)致卵泡破裂排卵[5-6]?；谀肛i的繁殖生理規(guī)律，定時(shí)輸精技術(shù)是利用外源類似的生殖激素，人為調(diào)節(jié)并控制母豬群集中發(fā)情和排卵，從而實(shí)現(xiàn)在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)對繁殖母豬群進(jìn)行人工授精。對于后備母豬，由于個(gè)體生理狀態(tài)所處于的時(shí)期不同，卵泡發(fā)育處于不同階段，通過持續(xù)飼喂孕酮類藥物（烯丙孕素）可以調(diào)控后備母豬的情期階段。對于經(jīng)產(chǎn)母豬，一般通過統(tǒng)一斷奶處理即可初步完成同期的目的；之后，再對2 種母豬群體應(yīng)用卵泡和排卵同步化激素，選定特定時(shí)間完成人工輸精操作。

1.1 調(diào)節(jié)母豬發(fā)情和卵泡發(fā)育的外源生殖激素 目前，用于刺激母豬卵泡發(fā)育的常用外源生殖激素為孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）、馬絨毛膜促性腺激素（Equine Chorionic Gonadotropin，eCG）和人絨毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，hCG）或豬促黃體素（Porcine Luteotropic Hormone，pLH）聯(lián)用等[7-9]。雖然eCG 通常做為FSH 的有效替代品，但其也具有LH 特性方面的批次性差異[10]。對于初產(chǎn)和后備母豬使用eCG 時(shí)，由于其內(nèi)源性的LH 水平較低，需要將劑量增加至900～1 000 IU，或者選擇具有LH 樣活性的hCG與eCG 聯(lián)用，優(yōu)選200 IU 劑量的hCG 與400 IU 劑量的eCG 進(jìn)行組合使用[10-11]。對于哺乳28 d 的母豬，斷奶24 h 后，靜脈注射500～750 IU eCG 可刺激其卵泡同步發(fā)育直至格拉夫卵泡階段，這樣可使母豬更早地結(jié)束哺乳期，并恢復(fù)卵巢的卵泡周期發(fā)育[12]。對于具有發(fā)情周期的空懷后備母豬，通過喂食孕酮類激素（丙烯孕素）14～18 d（15～20 mg/d）抑制內(nèi)源性LH 分泌，在停藥后5～7 d 內(nèi)大約93% 的母豬可以進(jìn)入發(fā)情期[13]。盡管eCG 和P4等激素可調(diào)控哺乳期或者發(fā)情間期至發(fā)情期的生理轉(zhuǎn)換，但它還不能控制發(fā)情期至排卵期的時(shí)間間隔[14]。

1.2 調(diào)節(jié)母豬排卵的外源生殖激素 斷奶母豬進(jìn)行eCG處理后，一般還需要通過GnRH、hCG 或者pLH 等激素處理后，才能控制其排卵時(shí)間[15-16]。外源性GnRH 是通過作用于垂體組織水平來誘導(dǎo)母豬內(nèi)源性LH 峰出現(xiàn)以控制最終排卵。因此，外源性的GnRH 效果往往取決于垂體內(nèi)的 LH 儲存水平[10]。例如，Driancourt 等[17]利用GnRH 的類似物Buserelin 處理斷奶77 h 后的母豬，發(fā)現(xiàn)在處理后的32～44 h 期間100%的經(jīng)產(chǎn)母豬被誘導(dǎo)排卵，而僅有50%的初產(chǎn)母豬在此期間排卵。Fries 等[18]利用GnRH 的另一類似物L(fēng)ecirelin 處理發(fā)情期母豬40 h 時(shí)，可誘導(dǎo)70.9% 的母豬排卵（對照組48.2%），處理至48 h 時(shí)，可誘導(dǎo)92.7%的母豬排卵（對照組82.4%）；處理組的分娩率、仔豬出生總數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、產(chǎn)死仔數(shù)和木乃伊胎兒與對照組間無顯著差異，但可有效縮短發(fā)情持續(xù)期以及減少發(fā)情期和排卵期之間的時(shí)間間隔。hCG 作為LH 的類似物，其主要在卵巢組織水平上起作用，而不受垂體組織儲存的內(nèi)源性LH 的分泌影響。通常給母豬注射hCG 后，可誘導(dǎo)85%～90% 的母豬于處理后39～49 h 內(nèi)排卵[10]。外源性p LH 也同樣在卵巢組織水平上發(fā)揮作用，發(fā)情的后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬在注射pLH 35～40 h 后可誘發(fā)排卵[16]。建立在母豬個(gè)體事先經(jīng)過eCG 等激素誘導(dǎo)發(fā)情同期化的基礎(chǔ)上，GnRH、hCG或者p LH 均可調(diào)控母豬的排卵同步化，并且不會顯著影響分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)等繁殖性狀。

1.3 定時(shí)輸精的時(shí)間確定 在20 世紀(jì)90 年代，研究者們就已發(fā)現(xiàn)母豬發(fā)情期間內(nèi)的排卵時(shí)間變化多樣，導(dǎo)致起始發(fā)情至排卵的時(shí)間間隔也會發(fā)生變化[19-21]。另外，母豬斷奶后至起始發(fā)情的時(shí)間間隔（Wean-to-Estrus Intervals，WEI）也會存在個(gè)體差異。較短時(shí)間的WEI，無論是自然狀態(tài)下還是在對外源促性腺激素的應(yīng)答情況，都會表現(xiàn)為發(fā)情期的適當(dāng)延長；相反，較長時(shí)間的WEI 會導(dǎo)致發(fā)情期有所縮短[14,22]?？紤]到排卵往往發(fā)生于發(fā)情期約70% 的時(shí)間節(jié)點(diǎn)處，因此，其綜合效應(yīng)是WEI 較短的母豬其排卵時(shí)間較晚（起始發(fā)情至排卵時(shí)間間隔＞40 h），而WEI 較長的母豬其排卵時(shí)間較早（起始發(fā)情至排卵時(shí)間間隔＜24 h）。鑒于母豬排卵與發(fā)情、斷奶的時(shí)間關(guān)聯(lián)性，定時(shí)輸精時(shí)間要么依賴于母豬斷奶后的誘導(dǎo)發(fā)情時(shí)間，要么依賴于發(fā)情期內(nèi)的誘導(dǎo)排卵時(shí)間[10]。

2 豬定時(shí)輸精方案的研究進(jìn)展

根據(jù)對激素處理母豬是否需要進(jìn)行發(fā)情鑒定，可將豬的定時(shí)輸精分為簡式定時(shí)輸精方案和精準(zhǔn)定時(shí)輸精方案。簡式定時(shí)輸精主要通過連續(xù)飼喂烯丙孕素一段時(shí)間，停喂數(shù)天后，是基于發(fā)情鑒定的定時(shí)輸精技術(shù)。精準(zhǔn)定時(shí)輸精則是利用PMSG 調(diào)控母豬的發(fā)情和卵泡發(fā)育同期化，再憑借GnRH、hCG 或pLH 等生殖激素促進(jìn)母豬排卵同步化，無需要對母豬進(jìn)行發(fā)情鑒定，而在固定時(shí)間進(jìn)行的定時(shí)輸精方案。

2.1 簡式定時(shí)輸精方案

2.1.1 后備母豬的簡式定時(shí)輸精方案 在后備母豬上，簡式定時(shí)輸精方案僅需連續(xù)飼喂烯丙孕素即可實(shí)現(xiàn)。后備母豬一般可連續(xù)飼喂烯丙孕素14～18 d，停喂后5～7 d內(nèi)查情，待出現(xiàn)靜立反應(yīng)時(shí)，可立即輸精1 次，16 h 進(jìn)行第2 次輸精。Spencer 等[23]對青年后備母豬先進(jìn)行400 IU 的eCG 和200 IU 的hCG 聯(lián)用處理，10 d 后開始飼喂烯丙孕素持續(xù)14 d；停止飼喂后每天2 次查情，依據(jù)起始發(fā)情后24 h 或者24 h 和32 h 的時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行定時(shí)輸精，測得其試驗(yàn)?zāi)肛i的排卵時(shí)間約為起始發(fā)情后33 h，并且得出授精和排卵時(shí)間間隔越長，后備母豬的妊娠率和胚胎存活率越低。

2.1.2 經(jīng)產(chǎn)母豬簡式定時(shí)輸精方案 Driancourt 等[17]則通過給斷奶后77 h 的母豬分別注射6、10、16 μg 的GnRH 類似物Buserelin 實(shí)施誘導(dǎo)排卵，發(fā)現(xiàn)分別有73%、73%和83%的試驗(yàn)?zāi)肛i在注射后32～44 h 內(nèi)排卵，但組間差異不顯著；而3 組中的經(jīng)產(chǎn)母豬在注射后的32～44 h 內(nèi)100%排卵，初產(chǎn)母豬在此時(shí)間窗口內(nèi)分別只有50%、50% 和67% 成功排卵。出現(xiàn)上述明顯差異現(xiàn)象，即GnRH 在誘導(dǎo)初產(chǎn)母豬斷奶后的排卵效果較差，可能因?yàn)槿缜八龅腉nRH 誘導(dǎo)排卵很大程度上依賴于垂體內(nèi)的 LH 儲存水平。Zak 等[24]在檢測到母豬起始發(fā)情后，立即注射5 mg pLH 進(jìn)行誘導(dǎo)排卵，在發(fā)情出現(xiàn)后24～42 h 內(nèi)進(jìn)行2 次輸精，發(fā)現(xiàn)pLH 有促進(jìn)產(chǎn)仔數(shù)增加的趨勢。Fontana 等[25]采用Zak 等[24]類似的pLH 處理方案，比較了定時(shí)輸精時(shí)間（發(fā)情后24 h 單次輸精，0 h 和24 h 2 次輸精）對分娩率和排卵時(shí)間等指標(biāo)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異不顯著，指出經(jīng)過pLH 處理的發(fā)情母豬，給予單次輸精不比2 次輸精效果差。結(jié)合現(xiàn)有的報(bào)道，針對經(jīng)產(chǎn)母豬的簡式定時(shí)輸精方案：經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶處理72 h 后，注射GnRH 誘導(dǎo)排卵，之后在32～44 h查情，待出現(xiàn)靜立反應(yīng)時(shí)，立即輸精1 次，16 h 后再進(jìn)行第2 次輸精。

上述輸精時(shí)間在一定程度上都依賴于發(fā)情鑒定。然而，除了查情次數(shù)和觀測人員的評判經(jīng)驗(yàn)會對發(fā)情鑒定有所影響以外[20,26]，查情工作本身在實(shí)際生產(chǎn)中也屬于耗時(shí)耗力的勞動(dòng)密集型項(xiàng)目[27-28]。因此，通過外源生殖激素對母豬發(fā)情和排卵的時(shí)間調(diào)控，嚴(yán)格意義上的程序化精準(zhǔn)定時(shí)輸精（Fixed-Timed Artificial Insemination，F(xiàn)TAI）更具有大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用前景。

2.2 精準(zhǔn)定時(shí)輸精方案

2.2.1 后備母豬精準(zhǔn)定時(shí)輸精方案 對于后備母豬實(shí)施FTAI，基本是通過飼喂烯丙孕素結(jié)合eCG 注射來調(diào)控卵泡生長，并選擇適當(dāng)時(shí)間注射GnRH、hCG 或p LH控制排卵時(shí)間，最終通過一兩次固定精準(zhǔn)時(shí)間進(jìn)行人工授精。20 世紀(jì)80 年代，Davis 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)飼喂烯丙孕素18 d 后第5、6、7 天進(jìn)行的定時(shí)輸精與發(fā)情鑒定后進(jìn)行人工授精的后備母豬發(fā)情、分娩仔豬數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)差異不顯著，并由此提出無需查情的精準(zhǔn)定時(shí)輸精有助于母豬育種群體的管理。Martinat-Botté 等[30]指出后備母豬在18 d 烯丙孕素飼喂預(yù)處理后24 h 給予eCG 注射，預(yù)處理后104 h 再給予GnRH類似物Buserelin 注射，在預(yù)處理后的128 h 和144 h進(jìn)行2 次定時(shí)輸精，結(jié)果相比于僅在預(yù)處理后104 h 進(jìn)行Buserelin 注射的母豬，其排卵數(shù)還有所增加；并得出在預(yù)處理后更晚的120 h 進(jìn)行Buserelin 注射時(shí)排卵的同步性較差。Degenstein 等[16]通過對后備母豬喂食14～18 d 的烯丙孕素，最后一次飼喂24 h 后注射eCG，在eCG 處理后的80 h 比較了hCG、pLH 和生理鹽水處理對此后第32 小時(shí)進(jìn)行定時(shí)輸精的影響，發(fā)現(xiàn)pLH 處理組的排卵時(shí)間更加集中，即p LH 處理后定時(shí)輸精的效果更佳。

在國內(nèi)，由于pLH 的緊缺和國家的相關(guān)規(guī)定，pLH 并沒有得到較為廣泛的應(yīng)用；一般都是通過注射GnRH 的類似 物Buserelin 和Triptorelin 來 間 接 促進(jìn)pLH 的釋放[31]?；趪鴥?nèi)生殖激素公司所生產(chǎn)激素品類，后備母豬一般采用精準(zhǔn)定時(shí)輸精方案，即通過18 d 連續(xù)不斷地對后備母豬飼喂烯丙孕素，并在停喂42 h 后注射1 000 IU 的PMSG 可保證卵泡發(fā)育同步化，80 h 后注射100 μg GnRH 以促進(jìn)同時(shí)排卵，在此后的第24 小時(shí)和第40 小時(shí)進(jìn)行2 次人工輸精（精液中添加10 μg縮宮素效果更佳）[2,32]。

2.2.2 經(jīng)產(chǎn)母豬精準(zhǔn)定時(shí)輸精方案 Christenson 等[33]針對哺乳3 周或6 周的母豬進(jìn)行斷奶24 h 后注射1 000 IU的PMSG，注射 后72 h 或56 h 給予500 IU 的hCG 處理，處理24 h 后進(jìn)行單次人工授精的處理組產(chǎn)仔數(shù)極顯著高于通過發(fā)情鑒定后進(jìn)行人工授精的對照組。Brüssow 等[15]對初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬斷奶24 h 后注射1 000 IU的eCG， 注 射 后 在55～58 h 給 予25 μg 和50 μg 的GnRH-A 處理，在處理后的24 h 和42 h 進(jìn)行2 次人工授精處理組的妊娠率、產(chǎn)活仔數(shù)與陽性對照組相差無幾。Stewart 等[34]則通過在斷奶96 h 后的母豬陰道內(nèi)給予100 μg GnRH 類似物Triptorelin 誘導(dǎo)排卵，之后8 h 和32 h 進(jìn)行2 次精準(zhǔn)定時(shí)輸精，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)肛i與自然發(fā)情后依據(jù)查情后多次授精的母豬的繁殖性能無明顯差異。在國內(nèi)，針對斷奶母豬一般采用精準(zhǔn)定時(shí)輸精方案，即對哺乳3 周以上的母豬統(tǒng)一實(shí)施斷奶，24 h 后注射1 000 IU 的PMSG 可保證卵泡發(fā)育同步化，72 h 后注射100 μg 的GnRH 以促進(jìn)同時(shí)排卵，在此后的第24、40 小時(shí)進(jìn)行2 次人工輸精（精液中添加10 μg 縮宮素效果更佳）[32,35]。

3 豬定時(shí)輸精手段及存在的問題

目前，豬生產(chǎn)中的定時(shí)輸精技術(shù)在實(shí)際操作過程中一般采用子宮頸輸精。子宮頸輸精操作方便、簡單，但需要較大劑量的精液以確保足夠數(shù)量的精子到達(dá)子宮輸卵管連接處，以便在輸卵管的峽部建立可使所有排卵的卵母細(xì)胞受精的健康精子儲存庫。在進(jìn)行子宮頸輸精時(shí)，通常利用80～100 mL 稀釋后的精液，攜帶25 億～30 億個(gè)精子，沉積至子宮頸后部的褶皺中來保證輸精精子數(shù)量[36]。然而，有30%～40%的精子在輸精后的1 h 內(nèi)會通過生殖道回流的方式損失掉[37-38]，其余精子則必須要穿越生殖道內(nèi)各種屏障才能到達(dá)子宮輸卵管連接處，例如要繼續(xù)克服子宮頸后的各種褶皺，逃避子宮內(nèi)的免疫系統(tǒng)攻擊等；最終，能到達(dá)子宮輸卵管連接處的精子僅有1 萬個(gè)，到達(dá)輸卵管峽部的精子則僅有1 000 個(gè)[39]。絕大多數(shù)的精子并未參與受精，造成了精子的巨大浪費(fèi)。為提高對公豬的精液利用率，未來可能需要借助一些其他輸精手段來實(shí)現(xiàn)較少精液的輸精，如子宮內(nèi)輸精、子宮角深部輸精和利用內(nèi)窺鏡的子宮輸卵管連接處輸精和輸卵管中部輸精[40-43]。Rath[43]曾指出在子宮輸卵管連接處輸精時(shí)，只需輸精體積0.5 mL、精子數(shù)量大于1×106個(gè)，則可以使發(fā)情母豬順利受孕并產(chǎn)仔。

在輸精過程中，精液一般來源于稀釋后的低溫保存精液，需要臨時(shí)采精稀釋或者短距離調(diào)運(yùn)。逐漸發(fā)展起來的凍精技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)較長時(shí)間的保存和運(yùn)輸，但在精子成活率、受精率和產(chǎn)仔數(shù)方面表現(xiàn)較低[44]。同時(shí)，隨著技術(shù)進(jìn)步和研究需求，未來經(jīng)過熒光分選的性控精液和精子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因精液，這些新技術(shù)中的可供受精的精子數(shù)量少是一大瓶頸難題[36,45]。一方面需要選擇更為合適的輸精手段，保證更少的精子損失與正確的生殖道輸精部位；另一方面需要借助更為精準(zhǔn)的定時(shí)輸精技術(shù)，確保在正確的受精時(shí)間段內(nèi)提供充足的健康精子，最終尋找出完美的時(shí)空節(jié)點(diǎn)，完成必要的受精操作。

4 結(jié) 論

豬定時(shí)輸精技術(shù)可大幅提高母豬利用效率，是養(yǎng)豬生產(chǎn)中簡單有效的繁殖管理方法，方便規(guī)?；B(yǎng)豬企業(yè)高效地組織人員生產(chǎn)。不僅降低了配種員在查情和適時(shí)配種中的日常工作量，同時(shí)還可以解決一些母豬產(chǎn)后不發(fā)情的繁殖問題。鑒于豬定時(shí)輸精技術(shù)的操作優(yōu)勢和對企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的貢獻(xiàn)，在國內(nèi)該技術(shù)將逐漸普及并進(jìn)一步推動(dòng)養(yǎng)豬業(yè)的集約化和批次化生產(chǎn)。另外，豬定時(shí)輸精技術(shù)的生殖激素使用搭配或者輸精時(shí)間點(diǎn)的選擇仍有待改進(jìn)研究；同時(shí)，定時(shí)輸精與各種輸精操作手段的組合搭配及其輸精效果可能會成為未來的研究新熱點(diǎn)。