“分解纖維素的微生物的分離”疑點(diǎn)探討

趙 輝 龍秋月 ( 廣東省深圳大學(xué)附屬中學(xué) 深圳 58054； 廣東省深圳市寶安區(qū)新安中學(xué) 深圳 580)

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中生物學(xué)教材選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》中的一個(gè)課題，主要目的是使學(xué)生了解微生物分離的基本原理，掌握從土壤中篩選纖維素分解菌的技術(shù)，培養(yǎng)學(xué)生基于生物學(xué)知識(shí)進(jìn)行工程學(xué)思維、參與動(dòng)手實(shí)踐的能力。在實(shí)際教學(xué)中，師生對(duì)教材中的部分內(nèi)容存在種種疑問，本文梳理并分析了常見的四點(diǎn)疑惑，以期廣大一線教師更好地開展本課題的教學(xué)。

1 培養(yǎng)基中為何要添加非纖維素類碳源

教材中分別給出了纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基與鑒別培養(yǎng)基的配方，兩種培養(yǎng)基中都出現(xiàn)了非纖維素類的其他碳源，疑問： 如此一來，是否培養(yǎng)與分離的就不是單純的纖維素分解菌，為什么要配制這樣的培養(yǎng)基呢？

針對(duì)為什么在選擇性培養(yǎng)基中添加酵母膏和水解酪素的疑問，在教學(xué)時(shí)，首先應(yīng)引導(dǎo)學(xué)生關(guān)注選擇培養(yǎng)基的目的是為了創(chuàng)造適宜環(huán)境使某種微生物迅速繁殖，而其他微生物受抑制；其次，分析纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基中的碳源含量： 纖維素粉為5 g，酵母膏和水解酪素均分別為0.5 g；再者教材“微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)”中關(guān)于培養(yǎng)基成分的要求： 除了需要碳源、氮源、水、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)外，還需要滿足微生物生長對(duì)pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。由此，學(xué)生理解了在以纖維素粉為主要碳源、并添加少量酵母膏與水解酪素作為生長因子的環(huán)境中，該選擇培養(yǎng)基才可以更好起到富集培養(yǎng)的作用。

針對(duì)鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基添加含有淀粉的土豆汁可能引起假陽性的疑問，要明確： ①剛果紅可以與纖維素之外的其他多糖(如淀粉)發(fā)生顯色反應(yīng)；②用稀釋涂布平板法對(duì)微生物進(jìn)行鑒定要求平板上至少可以形成單個(gè)菌落；③由于微生物本身酶系統(tǒng)的影響，不同微生物對(duì)碳源的利用是有選擇性和順序性的。一般情況下，微生物會(huì)優(yōu)先利用淀粉，淀粉耗盡才會(huì)利用纖維素。在CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，微生物繁殖的速度很慢。在涂布后，為使單個(gè)微生物存活并發(fā)展為菌落，可以在鑒別培養(yǎng)基中加入適量土豆汁滿足纖維素分解菌株早期快速生長代謝的需求，效果比僅以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基更明顯。這是由于土豆汁中除了含有淀粉外，還含有豐富的鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)，以及維生素A、維生素C和B族類維生素，營養(yǎng)豐富，有利于微生物的繁殖。不過土豆汁的濃度不宜過大，一開始分解淀粉的微生物也會(huì)繁殖，但由于加入的淀粉量較少，隨著淀粉的消耗，這些微生物的生命活動(dòng)會(huì)逐漸受到抑制，最后只剩下纖維素作為唯一碳源，此時(shí)纖維素分解菌則能繼續(xù)利用纖維素繁殖并形成菌落，這也是為什么剛果紅染色法中產(chǎn)淀粉酶的微生物周圍形成的透明圈較為模糊的原因。

2 是否可以用纖維素粉代替CMC-Na

針對(duì)是否可用纖維素粉替代的疑問，通過查閱文獻(xiàn)可知： ①在纖維素剛果紅培養(yǎng)基中，使用CMC-Na作為唯一的碳源，可以保證獲得的菌株具有分解纖維素的高效性;②CMC-Na并非碳源的唯一選擇，也可以利用結(jié)晶纖維素為唯一碳源并結(jié)合剛果紅染色法來篩選菌株;③普通的纖維素粉也可以成為唯一碳源，只不過在配制前，應(yīng)對(duì)纖維素粉和瓊脂進(jìn)行預(yù)處理(纖維素粉加1 mol/L HCl溶液浸泡12 h，然后蒸餾水洗多次至pH達(dá)中性，再過濾、烘干)，以除去藥品中可能存在的其他碳源;④有研究發(fā)現(xiàn)，鑒別培養(yǎng)基中不設(shè)置唯一碳源會(huì)達(dá)到更理想的效果[1]。所以，教材中纖維素分解菌的選擇和鑒別培養(yǎng)基配方僅僅是一種參考，可以進(jìn)行適當(dāng)變動(dòng)或改進(jìn)。

3 為何透明圈中的纖維素分解菌菌落本身會(huì)呈現(xiàn)紅色

針對(duì)教材中圖2-13中透明圈中的纖維素分解菌菌落本身為何會(huì)呈現(xiàn)紅色的疑問，分析實(shí)驗(yàn)可知，在剛果紅—纖維素固體培養(yǎng)基上，纖維素被水解后，菌落周圍顏色變淺形成透明圈，顏色濃郁的紅色物質(zhì)主要集中在菌落生長區(qū)域；透明圈中紅色物質(zhì)主要集中在菌絲中，菌絲周圍的紅色顯著變淺甚至無色。

研究表明，纖維素類物質(zhì)被微生物分泌的酶水解后形成大量含有β-1， 4-D-吡喃型葡萄糖與β-1， 3-D-葡聚糖及乳糖-葡甘露糖聚合糖等結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，與剛果紅染料結(jié)合形成大量的紅色多聚糖-剛果紅復(fù)合物，菌絲吸收多聚糖-剛果紅復(fù)合物，使剛果紅也伴隨著多聚糖進(jìn)入了菌絲體，所以菌絲周圍培養(yǎng)基的顏色變淺甚至無色[2]。而進(jìn)入菌絲中的多聚糖-剛果紅復(fù)合物進(jìn)一步被真菌分解為可以利用的小分子多糖加以吸收，無法被利用的剛果紅染料則沉積在菌絲中，或進(jìn)入菌絲與真菌細(xì)胞中的葡聚糖成分再次結(jié)合，形成多聚糖-剛果紅復(fù)合物，使剛果紅固定在細(xì)胞內(nèi)，最終使菌絲呈現(xiàn)紅色。

4 以透明圈大小作為菌株產(chǎn)纖維素酶活力大小的定量指標(biāo)是否可靠

剛果紅染色法是目前公認(rèn)的一種有效分離纖維素分解菌方法。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，即使是低活菌株也能形成清晰的水解圈，具有明顯的可識(shí)別性。這是由于纖維素酶是一種復(fù)合酶,由C1酶(內(nèi)切葡聚糖酶： 這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1， 4糖苷鍵，將長鏈纖維分子截?cái)?，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素)、Cx酶(外切葡聚糖酶： 作用于纖維素分子的非還原端，依次水解β-1， 4糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子)和葡萄糖苷酶(水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對(duì)纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降)組成。它們一起組成復(fù)合酶系，實(shí)際的降解過程是多種組分共同催化水解的結(jié)果。但在實(shí)踐中，測定這三種組分酶酶活力所用底物分別是脫脂棉、CMC-Na和對(duì)硝基酚-β-葡萄糖苷，所以在降解梭甲基纖維素(CMC)時(shí)，菌落透明圈大小只能表征Cx酶活力高低，并不能反映微生物分解纖維素的真實(shí)能力。

另外，雖然可根據(jù)透明圈的大小以及出現(xiàn)的遲早粗略估計(jì)菌株產(chǎn)酶情況，卻不能真正代表菌株的產(chǎn)酶能力，僅以水解圈大小作為菌株產(chǎn)纖維素酶活力大小的唯一定量指標(biāo)是不太可靠的。因?yàn)榘l(fā)酵生產(chǎn)中體積生產(chǎn)率(volume productivity)即單位質(zhì)量菌體，單位時(shí)間內(nèi)合成目標(biāo)產(chǎn)物的數(shù)量是生產(chǎn)成本的決定性因素。但在菌種選育和條件優(yōu)化試驗(yàn)中，都習(xí)慣以單位體積的產(chǎn)物量為依據(jù)，忽略了時(shí)間和菌體量這兩個(gè)制約因素，其結(jié)果往往使發(fā)酵周期長、生產(chǎn)效率低的菌株被作為目標(biāo)菌株投入大生產(chǎn)。

綜上，為確定得到的是纖維素分解菌，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的復(fù)篩實(shí)驗(yàn)必不可少。實(shí)驗(yàn)室一般用濾紙作為底物，因?yàn)闉V紙是聚合度和結(jié)晶度都居中等的纖維性材料，結(jié)構(gòu)較為松散，非還原性末端也較多，容易同時(shí)被內(nèi)切酶和外切酶降解，再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等還原糖，此時(shí)用比色法定量測定還原糖的生成量，才可反映纖維素酶的總酶活力。