被子植物花粉管生長及雙受精作用的分子機理

黃紫筠 (首都師范大學生命科學學院 北京 100048)

雙受精(double fertilization)是被子植物特有的生殖方式，是區(qū)別于裸子植物的重要特征之一。雙受精現(xiàn)象是由俄國植物學家納瓦興于1898年發(fā)現(xiàn)。他以頭巾百合和細弱貝母為材料，觀察到卵細胞和極核同時分別與花粉管中釋放出來的兩個精子融合的過程，由此發(fā)現(xiàn)了被子植物的兩個精子都參與受精。作為植物胚胎學史上的重大里程碑，雙受精在生物學上具有重要意義。本文對被子植物雙受精作用的分子機理研究進展做一概述，為植物遺傳和育種學的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 花粉與柱頭識別

雙受精作用的第一步是傳粉，即雄蕊中花粉借助風力或昆蟲的作用落到同一朵花或另一朵花雌蕊柱頭上的過程?；ǚ勐湓谥^表面后，隨即引起一系列復雜的細胞形態(tài)變化和生理生化過程的發(fā)生，包括花粉黏附、花粉水合、花粉萌發(fā)長出花粉管、花粉管在花柱中極性生長并最終進入胚囊，完成雙受精。雄蕊花粉與雌蕊柱頭的黏附能力決定著受精作用能否順利發(fā)生，而不同物種由于其柱頭形態(tài)和生理特征的不同又會影響?zhàn)じ侥芊癯晒?。濕柱頭黏性大，干柱頭則借由乳突細胞粘附花粉，花粉黏附后釋放外壁蛋白與柱頭表面的蛋白相互識別并特異性結(jié)合，呈現(xiàn)“認可”的親和識別反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)蕓苔屬植物油菜和甘藍中先后發(fā)現(xiàn)的S位點相關(guān)蛋白SLR1和SLG通過與花粉包被的A類蛋白PCP-A結(jié)合從而影響花粉的黏附作用[2， 3]。黏附后親和識別反應(yīng)隨即發(fā)生并引起花粉的水合。由于被子植物成熟花粉含水量較低導致其代謝處于被抑制的水平，因此花粉的水合可以讓其恢復代謝活性，從而利于花粉管的萌發(fā)。近期研究結(jié)果顯示，B類花粉包被蛋白PCP-B是擬南芥花粉—柱頭相互作用水合檢查點的關(guān)鍵調(diào)控因子，當花粉表面丟失多個PCP-B時，不僅花粉水合作用嚴重受損，并且水合缺陷還會導致所研究的所有突變體的花粉粘附能力降低和花粉管生長延遲[4]。

2 花粉管萌發(fā)與生長

在花粉粒的壁上還有一定數(shù)量的萌發(fā)孔或萌發(fā)溝，花粉在柱頭上萌發(fā)時花粉管就由萌發(fā)孔或溝處向外突出生長，該過程中花粉通過柱頭油脂層吸收水分，逐漸萌發(fā)出花粉管。同時柱頭油脂層滲透出的水分所形成的梯度又引導著花粉管往柱頭乳突細胞處生長，最終花粉管突破柱頭細胞壁進入花柱的引導組織?；ǚ酃茉谝龑ЫM織中向胚珠生長階段會受到孢子體雌蕊組織的控制，稱為孢子體導向；離開引導組織過后，花粉管在胎座位置出現(xiàn)在假隔膜表面并向著珠柄表面生長，繼而轉(zhuǎn)向珠孔生長，直至進入胚囊。該階段的生長導向受到雌配子體的調(diào)控，稱為配子體導向[5]。

2.1 花粉管生長的孢子體導向 花粉管生長的孢子體導向主要與雌蕊花柱的引導組織有關(guān)。擬南芥ntt突變體由于引導組織正常發(fā)育存在困難，花粉管生長緩慢或提前結(jié)束，并且在從頂端柱頭到基部子房的生長過程中，花粉管的側(cè)向分化更為明顯，偏離子房的生長導致育性降低從而影響受精作用。這些實驗結(jié)果表明，引導組織對于提高被子植物受精效率具有關(guān)鍵作用，特別是與子房臨近的引導組織下部能通過自身分化和程序性死亡來促進花粉管的生長[6]。早期研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥雌配子體在花粉管由頂向基的生長過程中并不會發(fā)出信號引導其向胚珠生長，而孢子體組織對花粉管的導向一般認為基于兩種截然不同的原理——機械原理和化學原理，它們被認為是解釋花粉管在引導組織中定向生長的原因[7]。引導組織細胞分泌產(chǎn)生的引導區(qū)胞外基質(zhì)為花粉管從柱頭延伸至胚珠的生長提供機械導向框架。胞外基質(zhì)主要是由糖蛋白和蛋白多糖組成的大分子網(wǎng)絡(luò)，花粉管在引導組織中的定向生長是不斷與該網(wǎng)絡(luò)密切接觸并受其化學引導控制的過程。1995年，有研究報道煙草特異性阿拉伯半乳糖蛋白TTS由柱頭向胚珠方向的糖基化程度逐漸增高，并指出純化的TTS蛋白是一種對花粉管生長有積極作用的雌蕊組織成分[8]。后續(xù)研究也發(fā)現(xiàn)了對花粉管向性生長起重要引導作用的其他蛋白，如： 百合柱頭的小堿性蛋白質(zhì)chemocyanin和擬南芥中的同源蛋白plantacyanin均富含半胱氨酸黏附蛋白，它不僅參與花粉管由頂向基的極性生長，同時對花粉管自身的頂端生長也有促進作用。引導組織中的其他小分子物質(zhì)也在這個過程中發(fā)揮重要引導作用，如： γ-氨基丁酸(GBAB)是植物生殖生長過程中的一個重要信號分子，其濃度梯度在引導組織中的紊亂將導致花粉管纏繞成團而結(jié)束生長或偏離子房方向繼續(xù)生長[9]。其他小分子物質(zhì)如NO、 Ca2+和cAMP等，也與花粉管引導有關(guān)。

除了機械和化學導向研究，目前關(guān)于花粉管生長的分子機制研究越來越多。2003年《細胞》雜志報道擬南芥中轉(zhuǎn)氨酶(POP2)通過催化作用調(diào)控GBAB濃度水平從而控制花粉管的生長[9]。中國農(nóng)業(yè)大學葉德研究組分別于2005年和2011年先后報道了編碼果膠甲酯酶同源蛋白(VGD1)的基因和編碼木糖基轉(zhuǎn)移酶(MGP4)的基因為花粉管生長所必需。其中MGP4基因參與果膠的生物合成，在花粉管和根系生長中發(fā)揮重要作用[10]；VGD1基因在花粉粒和花粉管中特異表達，該基因功能受損使花粉中的果膠甲基酯酶活性降低到野生型的82%，大大延緩了花粉管在引導組織中的生長，導致擬南芥雄性生育力顯著下降[11]。

2.2 花粉管生長的配子體導向 花粉管穿過花柱，離開引導組織到達子房，隨后向著珠柄和珠孔端區(qū)域的生長由雌配子體細胞發(fā)出信號進行引導。根據(jù)配子體發(fā)出的信號是引導花粉管朝著珠柄生長亦或是朝著珠孔生長，配子體導向又被習慣性分為兩個階段： 珠柄引導和珠孔引導。吸引花粉管從胎座至珠柄伸長的信號機制知之甚少，當前研究集中于深度剖析花粉管到達離珠孔約10 μm距離時突然轉(zhuǎn)向珠孔進入胚珠的原因，并取得了重大進展。Tetsuya等[12]用藍豬耳做實驗材料，利用激光切斷術(shù)分別破壞其卵細胞、助細胞和中央細胞。結(jié)果顯示： 只有當助細胞被全部殺死時花粉管才無法正常進入胚珠，由此證明是靠近卵細胞的兩個助細胞吸引了花粉管，而且單個助細胞就足以產(chǎn)生吸引信號，而兩個細胞則增強了這種信號；盡管受精后仍存在一個助細胞，但不會再有花粉管向著胚珠生長，這種吸引的停止可能與阻止多精有關(guān)；助細胞中存在一個特殊結(jié)構(gòu)——絲狀器，它是由助細胞細胞壁加厚形成的，通過增大接觸和分泌面積吸引花粉管進入胚珠。該實驗室還發(fā)現(xiàn)，助細胞釋放的特異性吸引花粉管的物質(zhì)為一類富含半胱氨酸類防御素小肽(LURES)，通過注射物影響LURES的表達可削弱胚珠對花粉管的吸引能力[13]。研究發(fā)現(xiàn)，玉米中的一類只在卵器表達的、包含94個氨基酸的非富含半胱氨酸小肽(ZmEA1)，其在玉米基因遺傳改造后表達下調(diào)，珠孔對花粉管的近距離吸引也隨之有所減弱，從而導致胚珠不育，這表明ZmEA1參與了雌性配子體吸引花粉管所需的短距離信號傳遞[14]。同年Kasahara等[15]篩選擬南芥在雌性配子體中表達的基因時發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子家族基因(MYB98)，該基因只在助細胞中表達。轉(zhuǎn)錄因子家族基因突變體myb98助細胞中絲狀器發(fā)育異常，野生型花粉管能沿著珠柄生長但卻不能準確定位進入珠孔。AtLURE1小肽被鑒定為擬南芥中引導花粉管進入珠孔的引誘物質(zhì)，該小肽從助細胞分泌至絲狀器，下調(diào)表達將影響珠孔引導的精確性[16]。

雌配子體中除了助細胞會發(fā)出信號物引導花粉管向著珠孔生長以外，其他細胞也在這個過程中扮演著重要角色。2007年，楊維才研究組發(fā)現(xiàn)中央細胞在擬南芥花粉管誘導中起著至關(guān)重要的作用： 中央細胞特異表達的轉(zhuǎn)錄因子(CCG)突變體胚珠導向有所缺陷，CCG基因正常表達足以恢復胚珠對花粉管的正常吸引[17]。隨后他們發(fā)現(xiàn)一種與CCG互作的纖維素結(jié)合蛋白(CBP1)作為新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與了花粉管的引導調(diào)控[18]。遺傳分析表明，擬南芥中珠孔引導有缺陷的配子體突變體如myb98和ccg不能表達富含半胱氨酸的小肽(AtLURE1)。各類研究陸續(xù)展現(xiàn)雌配子在花粉管定向生長階段的吸引作用，但其要發(fā)揮導向功能的前提必須是在完全成熟情況下。有研究顯示擬南芥解旋酶基因(MAA)突變體胚珠發(fā)育遲緩，花粉管僅能沿著珠柄表面生長而不能進入珠孔[19]。

雌配子體發(fā)出引導信號過后，花粉管自身需要對這類信號進行識別、接收，并作出反應(yīng)。2013年瞿禮嘉研究組鑒定了兩個在擬南芥花粉管中優(yōu)先表達的受體樣激酶(LIP1/LIP2)，它們通過棕櫚酰化作用被固定在花粉管頂端區(qū)域的膜上，LIP1和LIP2同時失活導致花粉管引導進入珠孔的功能受損，顯著降低了花粉管對AtLURE1小肽的吸引力，該研究結(jié)果表明LIP1和LIP2是花粉管受體復合體的重要組成部分，它們能夠感知雌配子體發(fā)出的AtLURE1信號，從而指導花粉管向著珠孔導向生長，但是因為沒有細胞外結(jié)構(gòu)域，所以LIP1和LIP2可能不是感知雌性信號的膜受體。2016年，楊維才等在花粉管中篩選到了可以感知雌性誘導信號分子LURE1的膜表面受體蛋白激酶MDIS1、 MIK1和MIK2，并確定它們均為質(zhì)膜定位受體樣激酶。楊維才等還發(fā)現(xiàn)，LURE1小肽通過與這些激酶的細胞外結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合啟動花粉管的定向胚珠生長，發(fā)生上述激酶突變的花粉管對LURE1的感知反應(yīng)較弱，由此首次揭示了雌雄雙方信號識別和激活的分子機制。

3 精子釋放與細胞融合

在雌方信號吸引下花粉管進入胚珠，其生長逐漸減慢并停止，通過絲狀器進入胚囊中的一個助細胞，并引起該助細胞的程序性死亡降解，隨即花粉管爆裂釋放運輸?shù)膬蓚€精細胞完成自身使命，該過程稱為花粉管的接收。釋放的兩個精細胞，一個與胚囊中的卵細胞融合形成二倍體的合子發(fā)育成胚，另一個與中央細胞融合起始胚乳發(fā)育，至此雙受精過程宣告完成。成功受精的關(guān)鍵還取決于花粉管在運輸精細胞的過程中自身完整性的保持，只有花粉管破裂的時機和釋放精細胞的位點都正確受精才能成功，而破裂和釋放過程的發(fā)生又需要花粉管與助細胞雙方多種分子信號的交流。在雌配子體方面，已經(jīng)報道了在助細胞中對花粉管接收至關(guān)重要的多種成分： 類蛋白受體激酶(FERONIA， FER)在擬南芥助細胞表面和受體激酶NORTIA(NTA)、錨定蛋白LORELEI(LRI)相互作用，與下游的第二信使活性氧(ROS)和Ca2+一起調(diào)控助細胞對花粉管的接收效率。fer、nta和lri突變體中這些信號分子的異常表達導致胚珠內(nèi)的花粉管過度生長和精子釋放的失敗。此外，一種助細胞分泌的多肽ZmES4也有利于激活花粉管中的K+通道，從而觸發(fā)玉米花粉管爆裂[20]。在雄配子體方面，三個花粉表達的轉(zhuǎn)錄因子MYB的缺失產(chǎn)生了與類蛋白受體激酶突變體fer相同的表型，這些研究結(jié)果提示雌雄配子體共同參與了花粉管的爆裂[21]，花粉管到達助細胞之前導致早熟花粉管爆裂的突變也有報道。這些數(shù)據(jù)表明細胞壁、膜受體信號和離子動力對花粉管的完整性至關(guān)重要?；ǚ酃鼙雅c釋放的精確性是由細胞外信號分子與花粉管表面的受體相互作用控制的，但是這些信號通路的激活機制長時間未被知曉，直至2017年相關(guān)研究成果鑒定出擬南芥存在兩個相關(guān)受體： 蛋白激酶BUPS1、 BUPS2以及它們的多肽配體細胞快速堿化因子RALF4和RALF19，它們均是由花粉管表達并應(yīng)用于花粉管完整性的維持。BUPS1和BUPS2通過胞外域與類受體激酶ANXUR1/2相互作用，兩組受體都與RALF4和RALF19結(jié)合。這些受體—配體相互作用與雌性配體細胞快速堿化因子RALF34競爭，RALF34在一定摩爾濃度下會導致花粉管爆裂[22]。

4 結(jié)語

被子植物雙受精作用中雌雄配子體相互作用的分子機理正被逐步揭示。該過程從花粉黏附識別到精子釋放需要眾多信號的交流，每一步的異常都可能成為植物體有性生殖繁衍的障礙，由此可見植物體雙受精作用的復雜性與精確性。未來研究方向?qū)⒓性谛‰男盘柺荏w鑒定、小肽信號事件發(fā)生機制、小肽信號生物學功能及發(fā)現(xiàn)新信號事件方面[23]，因此雙受精過程完整畫面的呈現(xiàn)還有待科研工作者的共同努力。