冬蟲夏草內(nèi)生菌皮殼青霉菌化學(xué)成分的研究

馮 丹， 秦玲玲， 鄭東濱， 趙鑫雅， 曹雪鳳， 冉 向， 戴 宇， 鄧 赟

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 成都611137 中國(guó)）

皮殼青霉菌Penicillium crustosum 為半知菌亞門半知菌綱殼霉目杯霉科青霉屬真菌。 目前, 采用不同的培養(yǎng)條件, 從其代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)了吲哚類、 二酮哌嗪類、 喹啉類、 苯二氮卓類生物堿、 聚酮類、 沒食子酸等, 具有抗增殖、 抗炎、 神經(jīng)毒性等作用[1-3]。 冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材, 具有免疫調(diào)節(jié)、 抗菌、 抗腫瘤、 抗氧化、 抗衰老、 降血糖血脂等藥理作用, 且僅生長(zhǎng)在青藏高原高寒地區(qū)[4]。 其內(nèi)生菌與冬蟲夏草的長(zhǎng)期的生存過程中可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝和防御機(jī)制, 進(jìn)而更易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、 活性廣泛的代謝產(chǎn)物。 之前在對(duì)其內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎具有顯著生物活性的化合物[5]。 課題組也從冬蟲夏草內(nèi)生菌中分離得到了多個(gè)化合物, 從中發(fā)現(xiàn)了新穎結(jié)構(gòu)[6-8]。 從冬蟲夏草中成功分離到一株內(nèi)生菌P. crustosum, 對(duì)其大米固體發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行研究。 本實(shí)驗(yàn)從中分離得到13 個(gè)化合物, 其中化合物1～7、 9～13 為首次從該菌中分離得到。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Finnigan-LCQDECA 質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）； Bruker Ascend 400 核磁共振儀（德國(guó)布魯克公司）； 中壓層析柱[利穗科技（蘇州）有限公司]； NP7000 型制備型高效液相色譜儀（江蘇漢邦儀器有限公司）； 柱層析硅膠（300 ～400 目）、 薄層層析硅膠板（青島海洋化工廠）；Pack ODS-A HPLC 柱（日本YMC 株式會(huì)社）。

1.2 菌種來源 于新鮮冬蟲夏草中分離得到一株內(nèi)生真菌（編號(hào)DCXC-20160503-XHX-20160908-2-1-1）。 將其進(jìn)行測(cè)序, 根據(jù)形態(tài)特征和18S rRNA基因序列比對(duì), 鑒定該菌株為 Penicillium crustosum。 該菌種現(xiàn)保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生化制藥實(shí)驗(yàn)室。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 活化培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L、 土豆（去皮） 200 g/L、 瓊脂18 g/L。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L、 可溶性淀粉8 g/L、 蛋 白 胨5 g/L、 酵 母 膏2 g/L、 氯 化 鈉2 g/L、 碳酸鈣2 g/L、 硫酸鎂0.5 g/L、 磷酸氫二鉀0.5 g/L。

1.3.3 大米固體培養(yǎng)基 大米40 g/瓶, 蛋白胨2 g/瓶, 自來水40 mL/瓶。

2 提取與分離

將活化后的P. crustosum 菌株接種于種子培養(yǎng)基中, 于28 ℃、 200 r/min 條件下培養(yǎng)2 d 得到種子液, 再將種子液轉(zhuǎn)接到滅菌后的300 瓶裝有大米固體培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中, 室溫下靜置培養(yǎng)40 d。 發(fā)酵完畢, 將發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇超聲提取3 次后, 合并后濃縮得到浸膏, 再用乙酸乙酯萃取3 次, 合并萃取液, 回收溶劑得到浸膏224.1 g。

將乙酸乙酯部位浸膏經(jīng)硅膠柱層析分離, 以石油醚-丙酮梯度洗脫, 分析合并, 得到組份A（20.0 g）、 B （5.5 g）、 C （0.9 g）、 D （29.4 g）、E （22.6 g）、 F （43.5 g）、 G （8.7 g）、 H （2.1 g）。 組份C 經(jīng)Sephadex LH-20 柱層析, 由三氯甲烷-甲醇 （1 ∶1） 洗脫, 分析合并得到組份C1（75.8 mg）、 C2 （109.6 mg）、 C3 （403.6 mg）、C4 （148.3 mg）、 C5 （50.0 mg）。 組份C2 經(jīng)半制備HPLC 分離得化合物1 （28.4 mg）。 組份C3 經(jīng)半制備HPLC 分離得化合物2 （2.5 mg）、 3 （1.4 mg）、 4 （1.2 mg）。 組份C4 經(jīng)半制備HPLC 分離得化合物5 （2.5 mg）、 6 （1.4 mg）。 組份C5 經(jīng)半制備HPLC 分離得化合物7 （5.6 mg）、 8 （4.5 mg）、 9 （1.3 mg）。 組份D 經(jīng)MCI 柱層析, 由甲醇-水（3 ∶7 ～10 ∶0） 洗脫, 分析得到25 個(gè)亞組份D1～D25, 組份D6 經(jīng)半制備HPLC 分離得到化合物10 （1.3 mg）。 組份D8 經(jīng)半制備HPLC 分離得化合物11 （7.0 mg）。 組份D9 經(jīng)半制備HPLC分離得化合物12 （1.14 mg）。 組份D10 經(jīng)半制備HPLC 分離得化合物13 （9.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 黃色粉末； ESI-MS m/z： 317 [M+Na]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 12.81 （1H,s, 5-OH）, 7.31 （1H, s, H-7）, 5.93 （1H, s, 2-OH）, 4.81 ～4.70 （1H, m, H-10）, 2.75 ～2.69（1H, m, H-4b）, 2.51 （3H, s, H-14）, 2.46 （1H,dd, J=16.6, 11.9 Hz, H-4a）, 2.14 （3H, s, H-15）, 2.02 （1H, dd, J= 14.3, 10.8 Hz, H-9b）,1.80 （1H, td, J=14.1, 3.8 Hz, H-3）, 1.31 （3H,d, J= 6.2 Hz, H-11）, 1.15 ～1.13 （3H, m, H-12）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 202.9 （C-13）, 160.4 （C-5）, 157.3 （C-8a）, 129.5 （C-7）,117.3 （C-8）, 112.7 （C-6）, 110.6 （C-4a）, 100.5（C-2）, 65.4 （C-10）, 44.2 （C-9）, 34.9 （C-3）,26.2 （C-14）, 25.0 （C-11）,23.7 （C-4）,15.8 （C-12, 15）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9] 基本一致, 故鑒定為6-乙?；?2α, 5-二羥基-2- （2-羥丙基） -3α,8-二甲基苯并二氫吡喃。

化合物2： 黃色油狀物； ESI-MS m/z： 113[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 5.82（1H, d, J=1.3 Hz, H-6）, 4.38 （2H, t, J=6.3 Hz, H-3）, 2.37 （2H, t, J=6.2 Hz, H-4）, 2.00（3H, s, H-7）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ：164.8 （C-1）, 157.8 （C-5）, 117.0 （C-6）, 66.0（C-3）,29.4 （C-4）,23.1 （C-7）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10] 基本一致, 故鑒定為4-甲基-5, 6-二氫吡喃酮。

化合物3： 白色粉末； ESI-MS m/z： 161 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 8.34 ～8.31（1H, m, H-6）, 8.06 （1H, s, H-2）, 7.79 ～7.69（2H, m, H-8,9）,7.51 （1H, t, J=7.4 Hz, H-7）,3.60 （3H, s, 3-CH3）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3）δ： 161.8 （C-4）, 148.5 （C-10）, 147.0 （C-2）,134.3 （C-8）, 127.6 （C-6, 9）, 126.5 （C-7）,122.2 （C-5）, 34.2 （3-CH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11] 基本一致, 故鑒定為3-甲基-4-喹唑啉酮。

化合物4： 黃色油狀物； ESI-MS m/z： 167 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 7.14 （2H,d, J=8.4 Hz, H-2, 6）, 6.78 （2H, d, J=8.4 Hz,H-3, 5）, 3.69 （3H, s, -OCH3）, 3.55 （2H, s, H-7）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 172.7 （C-8）,154.9 （C-4）, 130.6 （C-1）, 126.2 （C-2, 6）,115.7 （C-3, 5）, 52.2 （-OCH3）, 40.4 （C-7）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12] 基本一致, 故鑒定為4-甲氧基苯乙酸。

化合物5： 黃色油狀物； ESI-MS m/z： 155[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 3.82,3.85 （6H, s, -OCH3×2）, 6.34 （1H, dd, J=8.6,2.8 Hz, H-5）, 6.47 （1H, d, J= 2.7 Hz, H-3）,6.73 （1H, d, J = 8.6 Hz, H-6）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 150.2 （C-4）, 150.1 （C-2）,143.6 （C-1）, 112.6 （C-6）, 105.9 （C-5）, 100.8（C-3）, 56.7 （4-OCH3）, 56.0 （2-OCH3）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13] 基本一致, 故鑒定為2, 4-二甲氧基苯酚。

化合物6： 淺黃色粉末； ESI-MS m/z： 167[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 3.56（2H, s, H-7）, 3.70 （3H, s, -OCH3）, 6.74 （2H,d, J=8.0 Hz, H-3, 5）, 7.10 （2H, d, J=7.8 Hz,H-2, 6）；13C-NMR （100 MHz, CDCl3） δ： 173.51（C-8）, 155.2 （C-4）, 130.5 （C-2, 6）, 125.5 （C-1）, 115.7 （C-3, 5）, 52.3 （-OCH3）, 40.4 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7] 基本一致, 故鑒定為對(duì)羥基苯基乙酸甲酯。

化合物7： 無色針晶（甲醇）, mp 116～118 ℃；ESI-MS m/z： 123 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ： 9.80 （1H, s, H-7）, 7.83 ～7.77 （2H,m, H-2, 6）, 6.97 ～6.93 （2H, m, H-3, 5）；13CNMR （100 MHz, CD3OD） δ： 192.4 （-CHO）,163.8.0 （C-4）, 133.2 （C-2, 6）, 129.9 （C-1）,117.0 （C-3, 5）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14] 基本一致, 故鑒定為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物8： 無色粉末； ESI-MS m/z： 167 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CD3OD） δ：7.58 （1H, s,H-6）, 6.28 （1H, s, H-3）, 2.54 （3H, s, H-8）,2.16 （3H, s, H-9）；13C-NMR （100 MHz, CD3OD）δ： 204.1 （C-7）, 164.5 （C-4）, 164.7 （C-2）,134.1 （C-6）, 118.2 （C-1）, 114.0 （C-5）, 102.8（C-3）,26.2 （C-8）,15.8 （C-9）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9] 基本一致, 故鑒定為2, 5-二羥基-4-甲基苯乙酮。

化合物9： 無色粉末； ESI-MS m/z： 167 [M+H]+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.62 （1H,d,J=8.9 Hz, H-6）, 6.43 （1H, d, J=8.8 Hz, H-5）,2.57 （3H, s, H-8）, 2.08 （3H, s, H-9）；13C-NMR（100 MHz, CD3OD） δ： 204.3 （C-7）, 164.3 （C-4）, 164.1 （C-2）, 131.1 （C-6）, 113.9 （C-3）,112.2 （C-1）, 108.1 （C-5）, 26.1 （C-8）, 7.5 （C-9）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15] 基本一致, 故鑒定為2, 4-二羥基-3-甲基苯乙酮。

化合物10： 無色油狀物； ESI-MS m/z： 183[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CD3OD） δ： 6.70（2H, m, H-2, 5）, 6.56 （1H, d, J=7.8 Hz, H-6）, 3.66 （3H, s, -OCH3）, 3.46 （2H, s, H-7）；13C-NMR （100 MHz, CD3OD） δ： 174.5 （C-8）,146.3 （C-3）, 145.5 （C-4）, 127.0 （C-1）, 121.6（C-6）, 117.4 （C-2）, 116.3 （C-5）, 52.4 （-OCH3）, 41.2 （C-7）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16] 基本一致, 故鑒定為3, 4-二羥基苯乙酸甲酯。

化合物11： 白色粉末； ESI-MS m/z： 233 [M+Na]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ：5.75 （1H, s,N-H）, 4.15～4.09 （1H, m, H-6）, 4.02 （1H, dd,J=9.5, 3.5 Hz, H-9）,3.64～3.51 （2H, m, H-3）,2.40～2.31 （1H, m, H-5）, 2.19 ～1.98 （3H, m,H-4, 5, 10） 1.96 ～1.84 （1H, m, H-4）, 1.77 ～1.67 （1H, m, H-11）, 1.52 （1H, ddd, J=21.2,10.6, 5.8 Hz,H-10）,1.01 （3H,d,J=6.5 Hz,H-13）, 0.96 （3H, d, J = 6.5 Hz, H-12）；13C-NMR（100 MHz, CDCl3） δ： 170.2 （C-1）, 166.2 （C-7）,59.2 （C-6）, 53.5 （C-9）, 45.7 （C-3）, 38.8 （C-10）, 29.8 （C-5）,25.0 （C-11）,23.5 （C-4）,22.9（C-12）, 21.3 （C-13）。 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17] 基本一致, 故鑒定為環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）。

化合物12： 無色油狀物； ESI-MS m/z： 183[M+H]+。1H-NMR （400 MHz, CDCl3） δ： 6.83（1H, d, J=7.9 Hz, H-5）, 6.77 （2H, d, J=8.9 Hz, H-2, 6）, 3.88, 3.86 （6H, s, 3-OCH3, 4-OCH3）, 3.84 （2H, d, J = 6.4 Hz, H-8）, 2.82（2H, t, J = 6.5 Hz, H-7）；13C-NMR （100 MHz,CDCl3） δ： 149.3 （C-3）, 147.9 （C-4）, 131.1 （C-1）, 121.1 （C-6）, 112.5 （C-2）, 111.7 （C-5）,63.9 （C-8）, 56.1, 56.0 （-OCH3）, 38.9 （C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18] 基本一致, 故鑒定為3, 4-二甲氧基苯乙醇。

化合物13： 無色小針晶（氯仿）, mp 172.3 ～172.9 ℃； ESI-MS m/z： 205 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz, CDCl3） δ：7.78 （1H, d, J=8.2 Hz, H-6）, 7.60 （1H, s, H-2）, 6.92 （1H, d, J=8.3 Hz,H-5）, 3.95, 3.94 （each, 3H, s, -OCH3）；13C-NMR（100 MHz, CDCl3） δ： 172.0 （-COOH）, 153.9 （C-4）, 148.9 （C-3）, 124.8 （C-6）, 121.9 （C-1）,112.5 （C-2）, 110.5 （C-5）, 56.2, 56.1 （-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19] 基本一致, 故鑒定為3, 4-二甲氧基-苯甲酸。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從冬蟲夏草內(nèi)生菌P. crustosum 的大米固體發(fā)酵物中分離得13 個(gè)化合物, 主要為聚酮類和生物堿, 其中化合物1 ～7、 9 ～13 為首次從該菌種中分離得到。 此次得到化合物與文獻(xiàn)報(bào)道的情況有所差異, 原因可能為菌種來源和培養(yǎng)條件不同影響內(nèi)生菌基因的表達(dá), 進(jìn)而影響其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。 因此在內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的研究中, 可以通過改變培養(yǎng)基以及表觀遺傳修飾等手段進(jìn)行代謝產(chǎn)物的優(yōu)化。