水貂阿留申病毒感染過程中主要分子蛋白作用機理研究進(jìn)展

欒美慧，李健明，時 坤，劉 藝，徐 寧，郜艷雪，宮慶龍，孫志博，冷 雪*，杜 銳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；3.教育部動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室吉林省梅花鹿生產(chǎn)與產(chǎn)品應(yīng)用研究室，吉林長春130118)

水貂阿留申病(Aleutian mink disease，AMD)是由AMD 病毒(AMDV)感染水貂引起的自身免疫系統(tǒng)功能紊亂，并引發(fā)自身免疫的慢性、傳染性疾病，在全球范圍的水貂養(yǎng)殖國家造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。由于其特殊的致病機制和抗體依賴性增強作用(ADE)[3-4]，尚無預(yù)防該病的商業(yè)疫苗。目前主要通過檢疫淘汰病貂來凈化貂廠，但該方法無法從根本上杜絕該病的發(fā)生發(fā)展。因此國內(nèi)外對AMDV 致病機制進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明AMDV 中參與ADE 的結(jié)構(gòu)蛋白、負(fù)責(zé)調(diào)控病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白及宿主的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)在致病機制中具有重要作用。本文對AMDV 感染過程中各主要分子蛋白的相關(guān)調(diào)控進(jìn)行闡述，以期為AMDV 的致病機理以及進(jìn)一步研究和防治AMD 奠定理論基礎(chǔ)。

1 AMDV概述

AMDV 屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)阿留申細(xì)小病毒屬(Amdoparvovirus)，該病毒粒子直徑約24 nm～26 nm，無囊膜，結(jié)構(gòu)結(jié)實緊密，呈正二十面體對稱，對外界環(huán)境抵抗力強，耐熱，并耐受氯仿等有機溶劑。目前，已知的對AMDV 易感的動物種類已經(jīng)從水貂擴大為水貂、灰狐、臭鼬、貉等[5-9]，并且有相關(guān)研究人員在貂場養(yǎng)殖工人體內(nèi)檢測到了該病毒[10]。

新發(fā)現(xiàn)的貉藍(lán)狐阿留申病毒(RFAV)、火狐阿留申病毒(RFFAV)和灰狐阿留申病毒(GFAMDV)在2014年被國際病毒分類委員會納入阿留申病毒屬[11]。AMDV 對水貂的感染因水貂的年齡不同，其病理表現(xiàn)也不同。對成年水貂，AMDV 由Fc 受體介導(dǎo)感染其巨噬細(xì)胞。在幼年水貂中，病毒感染其肺泡II 型細(xì)胞并引起該細(xì)胞死亡。AMDV 可以通過血液、唾液、糞便和尿液的直接或間接接觸感染，還可以從感染的雌性水貂垂直傳播到幼年水貂。病毒粒子在環(huán)境中具有高度穩(wěn)定性，這種穩(wěn)定性使得病毒難以從受污染物體的表面清除，并使得病毒在野外、養(yǎng)殖場內(nèi)和養(yǎng)殖場之間傳播。

AMDV 為線性單股負(fù)鏈 DNA 病毒，基因組約為4 800 bp，包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)及兩個開放閱讀框，分別編碼結(jié)構(gòu) 蛋 白 VP1、 VP2 及 非 結(jié) 構(gòu) 蛋 白 NS1、 NS2、 NS3。AMDV 與其它細(xì)小病毒相似，依賴S 期復(fù)制，當(dāng)宿主聚合酶結(jié)合3' 末端發(fā)夾并且基因組被轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA 時，復(fù)制開始。盡管尚未明確AMDV 的復(fù)制機制，但是其中幾種復(fù)制中間體經(jīng)鑒定與細(xì)小病毒滾動發(fā)夾復(fù)制(RHR)模型一致。相關(guān)研究證明，AMDV 結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白在其感染致病過程中存在重要調(diào)控作用，且宿主Caspases 的活性和AMDV 各主要蛋白協(xié)同促進(jìn)了疾病的發(fā)展進(jìn)程[12]。

2 結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2

2.1 VP1 和VP2 的切割和活化研究表明 VP1 和 VP2在AMDV 復(fù)制中占有重要地位。AMDV 在貓腎細(xì)胞(Cr-FK)中參與復(fù)制的主要mRNA 為R2 mRNA。R2 mRNA 主

要編碼病毒衣殼蛋白VP1 和VP2，在病毒核衣殼中VP1和 VP2 的比例為 1∶9，在 VP1 中不存在磷脂酶 A2(PLA2)結(jié)構(gòu)域，在VP2 中含有主要的抗原決定簇[13]。Cheng 等人分別構(gòu)建了表達(dá) VP1、VP2 及VP1-VP2 融合蛋白的3 種質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染CrFK 細(xì)胞，結(jié)果顯示 AMDV 的衣殼蛋白VP1 和VP2 在病毒感染期間被Caspase 特異性切割成26 ku的小分子蛋白。為了進(jìn)一步驗證特異性切割衣殼蛋白的Caspase 種類，他們繼續(xù)構(gòu)建了表達(dá)GST-VP2 融合蛋白的重組質(zhì)粒，將表達(dá)并純化的融合蛋白與活化后的Casepase 1～Casepase10 分別孵育。結(jié)果顯示，僅有Caspase 7 能夠特異性切割GST-VP2，并在26 ku 處產(chǎn)生條帶。由此表明，Caspase 7 是在宿主體內(nèi)或在病毒感染期間裂解VP2的效應(yīng) Caspase[12]。

2.2 AMDV 的結(jié)構(gòu)蛋白 VP2 與 ADE 效應(yīng)AMDV 在感染過程中具有ADE 效應(yīng)，其也是AMDV 疫苗免疫失敗及導(dǎo)致宿主免疫功能紊亂的主要原因。有研究表明，AMDV能夠感染巨噬細(xì)胞，但由于很難獲得足夠數(shù)量的原代水貂巨噬細(xì)胞，所以Dworak 使用人類巨噬細(xì)胞系K562 檢測了AMDV 與巨噬細(xì)胞之間的相互作用，以闡明AMDV 基因表達(dá)和巨噬細(xì)胞功能在其感染過程中發(fā)生的變化[14]。研究顯示，在用針對鼠 Fc(γ)RIIA 單克隆抗體(IV.3)染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)分選AMDV 感染的K562 細(xì)胞，結(jié)果只有表達(dá)AMDV 基因的細(xì)胞呈IV.3 陽性，AMDV 對經(jīng)IV.3 孵育的K562 細(xì)胞的感染率可減少90 %，由此表明在 K562 細(xì)胞中 AMDV 的 ADE 是由 Fc(γ)RIIA 介導(dǎo)的[14]。另外，Cheng 等人證明，AMDV 衣殼蛋白 VP2 激活了Caspase 信號途徑，產(chǎn)生的26 ku 蛋白介導(dǎo)了ADE 及免疫復(fù)合物的形成[12]。因此，AMDV 的 ADE 是其衣殼蛋白VP2 與Fc 受體蛋白Fc(γ)RIIA 結(jié)合介導(dǎo)的。目前，ADE的機制尚不明確，但上述研究證明了AMDV 衣殼蛋白VP2 在其感染機制中的重要作用。

3 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1與病毒復(fù)制

非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)小病毒感染細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死，并且這一凋亡作用與病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 有關(guān)。細(xì)小病毒NS1 蛋白在病毒復(fù)制、病毒啟動子反式激活和細(xì)胞病變效應(yīng)的誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[15]。Aasted 等人以成年健康水貂為實驗動物，與未接種NS1 的水貂相比，接種NS1 蛋白的水貂感染AMDV 后的臨床表現(xiàn)更溫和，表明NS1 蛋白亞單位疫苗對水貂有一定的保護(hù)作用[15]。2005年，Castelruiz 等人構(gòu)建了表達(dá)NS1 蛋白的重組質(zhì)粒。然后，將18 只雌性水貂分成3 組：對照組、DNA 疫苗單次免疫組和用DNA 疫苗首免，重組 NS1 蛋白加強免疫組(DNA+NS1 蛋白)。免疫后，在32 周的觀察期中兩個免疫組在前23 周誘導(dǎo)了高水平抗體。另外，與其它兩組相比，“DNA +NS1 蛋白”組水貂顯示出更高水平的CD8+T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)。研究表明，兩個免疫組水貂均表現(xiàn)出較輕微的臨床癥狀，該實驗進(jìn)一步證明了NS1 蛋白接種水貂能夠?qū)ζ淦鸬揭欢ǖ谋Ｗo(hù)作用[16]。因此，NS1 蛋白在AMDV致病機理中發(fā)揮重要作用。

AMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 的功能與其它細(xì)小病毒類似，NS1 是AMDV 最大的多功能蛋白。AMDV 在宿主體內(nèi)增殖過程中表達(dá)NS1 蛋白，并且通過調(diào)控晚期蛋白而在病毒復(fù)制中起重要作用[16]。AMDV 的高效復(fù)制需要激活特異性Caspase 的活性，包括Caspase 3 和 Caspase 7。為研究病毒在復(fù)制過程中，NS1 蛋白的裂解與Caspase 的相關(guān)性，同時，確定裂解后NS1 蛋白在細(xì)胞中的定位，Best等人將感染AMDV 的CrFK 細(xì)胞裂解物分別與純化的Caspase 3 和Caspase 7 作用，與對照組相比，Caspase 作用的細(xì)胞裂解物產(chǎn)生兩種新的蛋白片段，分別為39 ku 和33 ku 蛋白分子，同時均檢測出一個大小約為27 ku 的片段。另外，通過添加Caspase 3 抑制劑，可以抑制這些片段的產(chǎn)生[17]。因此證明Caspase 能夠裂解AMDV 蛋白。為了確定Caspase 是否直接裂解AMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，將重組表達(dá)純化的NS1 蛋白與純化的Caspase 同時孵育，結(jié)果顯示，純化的NS1 蛋白在兩個位點被Caspase 裂解，并產(chǎn)生3 個片段，大小約為46 ku、39 ku 和33 ku，從而確定了Caspase 可以直接裂解NS1。為研究NS1 的裂解對其細(xì)胞核定位的影響，從而確定NS1 裂解產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位，Best 等人分別提取AMDV 感染細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在Caspase 切割后，大多數(shù)NS1 裂解蛋白存在于細(xì)胞核中。因此，AMDV 的NS1蛋白切割對AMDV 復(fù)制至關(guān)重要[17]。

4 非結(jié)構(gòu)蛋白NS2和NS3的作用

AMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白家族包括大分子非結(jié)構(gòu)蛋白NS1及小分子非結(jié)構(gòu)蛋白 NS2 和NS3[18]。據(jù)報道，為確定NS2 及NS3 蛋白在AMDV 感染期間的表達(dá)水平及該兩種蛋白的功能調(diào)控，Huang 等人利用AMDV G 株感染CrFK細(xì)胞，使用能夠同時識別NS1、NS2 和NS3 蛋白的兔多克隆抗體檢測AMDV 感染6 d 內(nèi)NS 蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在感染期間NS3 蛋白表達(dá)水平極低，NS2 蛋白及NS1 蛋白表達(dá)水平類似。為確定NS2 蛋白和NS3 蛋白的功能，Huang 等人將純化后的GST-NS2 融合蛋白及GST-NS3 融合蛋白分別免疫大鼠，并利用針對NS2、NS3的單克隆抗體檢測NS2 及NS3 的細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，在AMDV 感染期間，NS2、NS3 蛋白均在細(xì)胞核中表達(dá)。并將NS1 蛋白、NS2 蛋白及AMDV DNA 復(fù)制中心進(jìn)行細(xì)胞共定位試驗，結(jié)果顯示，NS2 蛋白可與NS1 蛋白在AMDV DNA 復(fù)制中心共定位。將NS1 蛋白、NS3 蛋白及AMDV DNA 復(fù)制中心進(jìn)行細(xì)胞共定位試驗，結(jié)果顯示，NS3 不與NS1 共定位，且其不在病毒DNA 的復(fù)制中心[19]。

為了進(jìn)一步探究NS2 和NS3 在AMDV 復(fù)制中的作用，Huang 等人利用AMDV 感染性克隆分別構(gòu)建了敲除NS1、NS2、NS3 蛋白的重組病毒，將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過免疫熒光試驗分別觀察三組重組病毒的抗體熒光強度。結(jié)果顯示3 組重組病毒的熒光強度均未發(fā)生改變。表明轉(zhuǎn)染后各重組病毒的復(fù)制水平?jīng)]有增強。同時，測定了子二代病毒的病毒滴度，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，3 種重組病毒均未產(chǎn)生復(fù)制形式的病毒DNA，不會產(chǎn)生感染性病毒，而野生型對照組(PIAMDV)產(chǎn)生了子代病毒，且病毒滴度為2.0×105cfu/mL[19]。上述結(jié)果表明，NS2 和NS3 蛋白在AMDV 感染CrFK 細(xì)胞過程中的表達(dá)，與AMDV 的DNA復(fù)制密不可分。

5 Caspase促進(jìn)病毒復(fù)制

AMDV 是DNA 病毒，其不僅誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且利用Caspase 活性來促進(jìn)病毒的復(fù)制[20]。AMDV 感染CrFK細(xì)胞可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞一種自我調(diào)節(jié)的生理過程，涉及正常的細(xì)胞轉(zhuǎn)換，其特征是細(xì)胞不同的形態(tài)變化和其DNA 降解[21]。其中Caspases 是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白，其活性中心含有半胱氨酸[22]，能夠特異性水解天冬氨酸。當(dāng)Caspase 活化后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Caspase 的活化涉及復(fù)雜的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)。目前，已知的Caspases 家族共有13 個成員(Caspase 1～Caspase 13)，Caspase 8、Caspase 9、Caspase 10 為凋亡啟動子，Caspase 3、Caspase 6、Caspase 7 為凋亡效應(yīng)分子。Best 等人通過TUNEL 染色、膜聯(lián)蛋白 -V 染色等試驗，證明AMDV 感染CrFK 后發(fā)生了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。隨后使用Caspase 3 及Caspase 廣譜抑制劑分別預(yù)處理CrFK 細(xì)胞后，感染AMDV 并觀察細(xì)胞凋亡狀態(tài)，結(jié)果表明，Caspase1、Caspase 6 和Caspase 8 的抑制劑并不能抑制細(xì)胞凋亡。因此，AMDV 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，依賴于特定Caspase的激活，使用特異性Caspase 抑制劑，才可以抑制細(xì)胞凋亡。另外，與未添加抑制劑的對照組相比，Caspase 抑制劑抑制了細(xì)胞的凋亡，并使實驗組的AMDV 復(fù)制減少了100 倍[23]。水貂腸炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)屬于細(xì)小病毒科，利用其感染CrFK 細(xì)胞，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但感染性MEV 的復(fù)制不受Caspase 抑制劑的影響。因此，在細(xì)小病毒中，AMDV 對Caspase 活性的依賴性復(fù)制具有唯一性。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，AMDV 的結(jié)構(gòu)蛋白VP1 和VP2 在感染期間被Caspases 特異性切割成26 ku 小分子蛋白，并且證實了 AMDV 26 ku 的切割蛋白與 Fc(γ)RIIA 結(jié)合介導(dǎo)了ADE 效應(yīng)，表明結(jié)構(gòu)蛋白在AMDV 的ADE 和致病機理中存在重要作用。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1 必須經(jīng)過Caspases 的特異性切割，才能起始病毒復(fù)制，表明非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒復(fù)制中有關(guān)鍵作用。對小分子非結(jié)構(gòu)蛋白NS2 和NS3 在AMDV 感染的CrFK 細(xì)胞過程中的表達(dá)水平的檢測，證實該兩個蛋白與AMDV 的DNA 復(fù)制密不可分。因此對于AMDV 的增殖和感染不僅依賴于宿主特異性Caspase 的激活和調(diào)控，而且和 AMDV 的主要蛋白 VP1、VP2、NS1、NS2 及 NS3 相關(guān)。

迄今為止，尚無防控AMD 的商品化疫苗，且通過對AMDV 基礎(chǔ)性研究，使人們意識到了AMDV 在感染過程中各分子蛋白的功能和調(diào)控機制在病毒復(fù)制及感染中具有關(guān)鍵意義。近年來國內(nèi)外加深了對AMDV 感染過程中各分子蛋白的分析和研究，明確了AMDV 無論在水貂體內(nèi)或者體外的感染復(fù)制，均具有一個相當(dāng)復(fù)雜的調(diào)控過程。因此要從病毒的蛋白表達(dá)、衣殼裝配和Caspases 活化之間的相互關(guān)系做更深入的研究，為避免ADE 和成功研制出有效的AMD 疫苗打下堅實的基礎(chǔ)。