星狀pH響應(yīng)聚合物及其自組裝膠束研究

羊惠燕，郭建維

（廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

由于環(huán)境污染和大氣霧霾等因素的影響，我國(guó)癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年上升，并成為危害人類生命的“第二號(hào)殺手”. 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)有429.2萬(wàn)新發(fā)癌癥病例和281.4萬(wàn)死亡病例[1-4]. 然而，常規(guī)化療中的抗癌藥物存在一些關(guān)鍵性的問題： (1) 藥物在體內(nèi)非特異性分布，對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞同時(shí)起毒副作用；(2) 腫瘤細(xì)胞存在耐藥性；(3) 腫瘤組織部位化療藥物濃度低、療效差[5-8]. 刺激-響應(yīng)性納米藥物控釋體系集傳感、處理及執(zhí)行功能于一體，能傳感病灶信號(hào)，并做出響應(yīng)，控制藥物定位定時(shí)定量地釋放，達(dá)到藥物控制智能化的目的，從而為新型抗癌藥物在不對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用的情況下最大化地發(fā)揮效用提供了一個(gè)有力的契機(jī).

在不同類型的刺激-響應(yīng)性納米藥物控釋體系中，pH響應(yīng)聚合物納米載藥膠束體系是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外藥物控釋領(lǐng)域最熱門的研究[9-10]. Lee等[11]合成了聚(L-組氨酸)-聚(乙二醇)嵌段共聚物并用于制備pH敏感性載藥膠束. 由于氨基在腫瘤細(xì)胞外pH值(pH=7.2)下質(zhì)子化，組氨酸重復(fù)單元中的疏水咪唑基團(tuán)變?yōu)橛H水性，觸發(fā)了抗癌藥物在腫瘤組織的釋放.Ko[12]以邁克爾加成法制備了一種用于藥物靶向輸送的pH敏感和可生物降解的聚乙二醇-聚(β-氨基酯)共聚物，并通過(guò)溶劑蒸發(fā)法制備DOX負(fù)載膠束.在體外藥物釋放試驗(yàn)中，DOX分子在酸性條件下迅速?gòu)膒H響應(yīng)性聚合膠束中釋放，并定位于細(xì)胞核內(nèi).通過(guò)評(píng)估pH響應(yīng)性聚合物膠束在B16F10荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤活性發(fā)現(xiàn)，與游離DOX相比，攜帶DOX的pH響應(yīng)性聚合物膠束能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間. 楊友強(qiáng)等[13-14]以季戊四醇為起始原料，設(shè)計(jì)合成了pH響應(yīng)的星型4/6臂聚合物聚己內(nèi)酯-b-聚甲基丙烯酸N，N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸單甲氧基聚乙二醇酯及其組裝膠束用于抗癌藥物的控制釋放. 研究發(fā)現(xiàn)該星型共聚物具有低的臨界膠束濃度(2.2～4.0 mg/L)和pH依賴性質(zhì). 但是，在pH為7.4時(shí)，40%的DOX從膠束釋放，對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生副作用. 金剛烷是一種高度對(duì)稱的籠狀烷烴，具有無(wú)毒無(wú)味、生物相容性好、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，其已廣泛應(yīng)用于功能材料、生物醫(yī)藥以及納米技術(shù)等領(lǐng)域[15]. 本文采用獨(dú)特親脂性和超疏水性的金剛烷替代傳統(tǒng)的季戊四醇，合成了pH響應(yīng)星狀聚合物Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4，其自組裝DOX負(fù)載膠束具有良好的穩(wěn)定性，并且能夠有效地控制DOX的釋放.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

ε-己內(nèi)酯(ε-CL，上海麥克林生化科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)用CaH2干燥48 h后，減壓蒸餾收集餾分，4A分子篩干燥備用；甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA，安耐吉化學(xué)試劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)和甲基丙烯酸單甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA，Mn=500，安耐吉化學(xué)試劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%)過(guò)堿性氧化鋁柱除阻聚劑；三乙胺(TEA，阿拉丁試劑，AR)用CaH2干燥過(guò)夜后，常壓蒸餾收集餾分，4A分子篩干燥備用；四氫吠喃(THF，安耐吉化學(xué)試劑，AR)：加入適量的Na和二苯甲酮進(jìn)行回流，等變藍(lán)色后收集餾分，4A分子篩干燥備用；甲苯(天津市致遠(yuǎn)試劑，AR)加入4A分子篩干燥備用；阿霉素?鹽酸(DOX·HCl)，2-溴異丁酰溴，辛酸亞錫(Sn(Oct)2)，五甲基二亞乙基三胺(PMDETA)，溴化銅(CuBr2)，正己烷，芘均為分析純.

AVANCE III 400 MHz核磁共振儀，瑞士Bruker公司；Waters 1525/2414凝膠滲透色譜儀，美國(guó)Waters公司；TalosF200S場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡，美國(guó)FEI公司；CTFD-10冷凍干燥機(jī)，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；FluoroMax-4熒光光譜儀，美國(guó)HORIBA Jobin Yvon公司；Zeta PALS Zeta電位及粒度分析儀，美國(guó)Brookhaven公司；UV-6000紫外-可見光譜儀，上海元析儀器有限公司；PHS-3C pH計(jì)；FA2004電子天平.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)以1,3,5,7-四羥基金剛烷Ad-(OH)4作為四官能團(tuán)引發(fā)劑，在其三維四臂方向開展ε-CL的開環(huán)聚合反應(yīng)，得到金剛烷基疏水性聚合物，隨后通過(guò)2-溴異丁酰溴改性，以及DEAEMA和PEGMA的ARGET ATRP聚合技術(shù)制備pH響應(yīng)星狀聚合物Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4，具體合成步驟如圖1所示.

圖1 星狀聚物Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4的合成路線Fig.1 Synthetic route of star polymer Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4

1.2.1 Ad-(PCL)4的合成

將Ad-(OH)4(0.126 g，0.63 mmol)加入到含有磁力攪拌子的100 mL反應(yīng)瓶中，用氬氣(Ar)吹掃3次.在Ar保護(hù)下依次加入ε-CL (6.32 g，55.4 mmol)和Sn(Oct)2的甲苯溶液(其中Sn(Oct)2含量為0.008 g)，于120 °C下反應(yīng)24 h. 反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)旋蒸除去甲苯，將粗產(chǎn)物溶于THF中，用10倍過(guò)量的正己烷沉淀后過(guò)濾，產(chǎn)物在40 °C的真空烘箱中干燥24 h.

1.2.2 Ad-(PCL-Br)4的合成

取100 mL的燒瓶，將攪拌子，Ad-(PCL)4(3 g，0.256 mmol)、無(wú)水THF(20 mL)和TEA(0.71 mL，5.11 mmol)依次加入到燒瓶中. 在劇烈攪拌和冰浴條件下，將2-溴異丁酰溴(0.60 mL，5.11 mmol)逐滴加到燒瓶中. 先在冰浴下反應(yīng)5 h后，室溫繼續(xù)反應(yīng)24 h.隨后，通過(guò)中性氧化鋁柱除去反應(yīng)產(chǎn)生的季銨鹽，然后旋蒸將大部分THF除去. 將所得溶液逐滴加入到冷的正己烷中，產(chǎn)物于40 °C下真空干燥24 h.

1.2.3 Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4的合成

在氬氣下將Ad-(PCL-Br)4(1.5 g，0.12 mmol)和催化劑CuBr2(0.027 g，0.12 mmol)加入100 mL干燥Schlenk燒瓶中. 用注射器依次將THF(18 mL)，單體DEAEMA(1.6 g，8.64 mmol)，配體PMDETA(0.05 mL，0.24 mmol)加入反應(yīng)瓶. 充分?jǐn)嚢韬?，將Sn(Oct)2(0.097 g，0.24 mmol) 的THF(2 mL)溶液加入到燒瓶中，繼續(xù)攪拌一段時(shí)間后于65 °C下反應(yīng). 反應(yīng)進(jìn)行4 h后，加入單體PEGMA(1.92 g，3.84 mmol)進(jìn)行連續(xù)聚合. 反應(yīng)結(jié)束后，將混合溶液冷卻至室溫，并用THF稀釋. 通過(guò)中性氧化鋁柱除去催化劑，并將溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮. 將所得溶液逐滴加入到正己烷中沉淀，產(chǎn)物在40 °C下真空干燥24 h.

1.3 載藥膠束的制備

DOX為模型藥物，采用透析技術(shù)制備Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4自組裝膠束. 具體步驟如下：稱取DOX·HCl (20 mg)溶于20 mL DMSO，加入2倍摩爾量的TEA，攪拌過(guò)夜得到DOX. 40 mg Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4溶于20 mL的DMSO中，在劇烈攪拌下將DOX加入溶液中. 將混合溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(MwCO=3.5 kDa)中，首先將透析袋置于磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中透析5 h，然后用去離子水繼續(xù)透析48 h，采用0.45 μm過(guò)濾器去除溶液中的大聚集體，最后冷凍干燥. 經(jīng)計(jì)算Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束的載藥量為10.5%，包封率為31.6%.

1.4 表征及性能測(cè)試

1.4.11H NMR表征

采用瑞士Bruker公司生產(chǎn)的AVANCE III 400 MHz超導(dǎo)傅里葉核磁共振波譜儀分析聚合物的化學(xué)組成及結(jié)構(gòu). 其中，氯仿(CDCl3)作為氘代試劑，四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo)，測(cè)試溫度為25 °C.

1.4.2 聚合物的GPC分析

采用美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的Waters 1525/2414凝膠滲透色譜儀進(jìn)行聚合物的分子量(Mn)以及分布系數(shù)(PDI)分析. 其中，THF(色譜純)作為洗脫劑(1.0 mL/min)，單分散聚苯乙烯(PS)作為標(biāo)樣.

1.4.3 熒光光譜測(cè)定

以芘作為探針，采用熒光光譜分析Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4在水溶液自組裝膠束的形成.在暗室下，分別取0.1 mL芘/丙酮溶液(6×10-5mol/L)加入多個(gè)棕量瓶中，揮發(fā)掉丙酮后向棕量瓶中加入一定量的聚合物母液和去離子水配制成0.000 1～0.1 mg/mL的待測(cè)溶液，并在暗示下平衡24 h以備測(cè)試. 測(cè)試條件：熒光掃描范圍為240～350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為373 nm，掃描間隔為4 nm. 將I335與I333比值對(duì)聚合物濃度的對(duì)數(shù)作圖，曲線突變點(diǎn)即Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4的CMC值.

1.4.4 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)

將40 mg Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4溶解于20 mL DMSO中，隨后轉(zhuǎn)移到透析袋中(MwCO=3.5 kDa)，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)透析48 h.所得溶液通過(guò)0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾以除去大聚集體，使用NaOH或HCl(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)膠束溶液的pH值，靜置半天后在室溫下通過(guò)DLS測(cè)試不同pH下的粒徑.

1.4.5 透射電子顯微鏡

將載藥Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束分散于無(wú)水乙醇中，超聲處理后將乙醇溶液滴加至300目的普通碳支持膜上，在空氣中晾干后采用TalosF200S觀察載藥膠束的形貌.

1.4.6 藥物釋放研究

在暗室下，稱取5 mg凍干載藥膠束分散在5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，6.8)或乙酸緩沖液(pH 5.0)中，將分散后的溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(MwCO=3.5 kDa)，將透析袋放入40 mL磷酸鹽緩沖液或醋酸緩沖液后在37 °C和100 r/min的振蕩水浴中攪拌. 在一定時(shí)間間隔內(nèi)取出4 mL溶液，立即加入相同體積的新鮮緩沖液以保持溶液的總體積不變. 采用UV-9600分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)在480 nm處溶液的吸光度，按照累積釋藥式(1)計(jì)算DOX的累計(jì)釋放量(Er). 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

式中，mDOX表示膠束中的DOX量；Ve是緩沖溶液的體積(Ve=4 mL)；V0是釋放介質(zhì)的體積(V0=45 mL)；Ci是第i次取樣時(shí)樣品的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4的合成與表征

Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4及其前驅(qū)體的凝膠滲透色譜表征結(jié)果如圖2和表1所示. 由圖可知，聚合物的分子量分布特點(diǎn)為對(duì)稱的單峰分布，表明ROP和ARGET ATRP反應(yīng)具有良好的可控性.表1列出了聚合物的數(shù)均分子量Mn和分布系數(shù)PDI，可以看出聚合物的分子量分布較窄，并且隨著反應(yīng)的進(jìn)行，分子量逐漸增大.

圖2 Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4及其前驅(qū)體的GPC譜圖Fig.2 GPC of Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4 and its precursor

表1 Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4及其前驅(qū)體的合成結(jié)果Tab.1 Synthesis results of Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4 and its precursor

Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4及其前驅(qū)體的核磁共振氫譜圖如圖3所示. 由圖可知，圖3(a)存在4個(gè)主峰：4.06，2.31，1.65以及1.38處的特征峰分別歸屬于(—C H2—O—)，(—C H2—C O—)，(—O—CH2—CH2—CH2—CH2—CH2—CO—)和(—CH2—CH2—CH2—)質(zhì)子，另外，金剛烷質(zhì)子的峰與(—CH2—CH2—CH2—)質(zhì)子的峰重合. Ad-(PCLBr)4的1H-NMR光譜中，見圖3(b)，3.65處歸屬于Ad-(PCL)4末端羥基的峰完全消失，而1.93處出現(xiàn)歸屬于(—C(CH3)2—Br)質(zhì)子的特征峰，這表明成功制備了Ad-(PCL-Br)4. 在圖3(c)所示的Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4的1H-NMR譜圖中，除了來(lái)自Ad-(PCL-Br)4的峰之外，0.89和 1.81分別為甲基丙烯酸酯骨架(—CCH3)和(—CH2—)質(zhì)子特征峰；在2.70和4.06處的峰歸屬于DEAEMA單元的(—CH2CH2—)質(zhì)子；在1.04和2.58處的峰被指定為DEAEMA單元的(—CH2CH3)質(zhì)子；在3.38，3.64和4.31處的峰分別是PEGMA單元的(—OCH3)，(—OCH2—CH2O—)和(—COO—CH2—)質(zhì)子的特征共振.

圖3 Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4及其前驅(qū)體的1H-NMR譜圖Fig.3 1H-NMR spectra of Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4 and its precursor

2.2 Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4的CMC測(cè)定

一般認(rèn)為，低CMC值的兩親聚合物會(huì)使膠束在血液循環(huán)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，并阻止化療藥物在到達(dá)癌細(xì)胞之前釋放[4]. 采用芘作為熒光探針，測(cè)試其在不同濃度的聚合物溶液中的熒光光譜，從而得到聚合物的CMC值，熒光光譜分析結(jié)果如圖4所示. Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4在水溶液中的CMC值為3.4 mg/L，表明該星狀聚合物膠束在溶液中具有良好的穩(wěn)定性，這有利于膠束在人體循環(huán)過(guò)程中被稀釋到極低濃度時(shí)也能保持結(jié)構(gòu)的完整.

2.3 pH值對(duì)Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束粒徑的影響

圖4 強(qiáng)度比(I335/I333)隨水溶液中聚合物濃度的對(duì)數(shù)變化的曲線圖Fig.4 Graphs of intensity ratios (I335/I333) as function of logarithm of polymeric concentrations in aqueous solution

圖5為空白聚合物膠束在水溶液中的粒徑隨pH的變化情況. 由圖可知，膠束的粒徑在pH 8～10范圍內(nèi)基本保持不變，當(dāng)pH從8降至4時(shí)，粒徑逐漸變大，并在pH=4時(shí)到達(dá)最大值，繼續(xù)降低溶液的pH，膠束粒徑逐漸變小. 這主要是因?yàn)樵谥行曰驂A性條件下，PDEAEMA側(cè)鏈的叔氨基完全去質(zhì)子化并且在PCL內(nèi)核周圍形成一層疏水層，膠束的結(jié)構(gòu)緊密；在酸性條件下，PDEAEMA側(cè)鏈的叔氨基逐漸質(zhì)子化，靜電排斥作用增加，膠束膨脹以平衡增加的靜電排斥[16]；當(dāng)pH下降到小于4時(shí)，靜電排斥大于膠束內(nèi)疏水相互作用，膠束結(jié)構(gòu)輕微解離，導(dǎo)致膠束的粒徑減少[17].

圖5 pH對(duì)Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束粒徑的影響Fig.5 Effects of pH on the particle size of Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4 micelles

2.4 DOX負(fù)載Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束的粒徑和形態(tài)

結(jié)合DOX后，由DLS測(cè)定DOX負(fù)載Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束的粒徑，結(jié)果如圖6所示. 由圖可知該星狀聚合物載藥膠束的粒徑分布系數(shù)(PDI)為0.078，平均直徑約為159.0 nm，膠束尺寸接近脂蛋白和病毒等天然介觀體系的尺寸，表明該聚合物膠束具有作為藥物輸送系統(tǒng)的獨(dú)特的生理特性. 采用透射電鏡觀察載藥膠束的形貌，結(jié)果如圖7所示. TEM圖像顯示膠束為核-殼結(jié)構(gòu)的球形顆粒，直徑約50 nm，這與DLS的數(shù)據(jù)不符. 這是由于TEM測(cè)試是在沒有溶劑的情況下獲得的，而DLS是在溶液中測(cè)試的[18].

圖6 DOX負(fù)載Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束的尺寸分布Fig.6 Particle size distribution of drug-loaded Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4 micelles

圖7 DOX負(fù)載Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束的透射電鏡圖Fig.7 TEM of drug-loaded Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4 micellles

2.5 DOX釋放性能評(píng)價(jià)

圖8為不同pH值下，載藥膠束的體外藥物釋放情況. 由圖可知，當(dāng)pH=7.4時(shí)，只有17%的DOX從Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束釋放；在pH=6.8下，DOX從聚合物膠束中的釋放速率略有提高，35 h僅增加10%，pH降至5.0時(shí)，53%的DOX從聚合物膠束迅速釋放. 這表明該聚合物膠束對(duì)內(nèi)涵體/溶酶體pH的敏感性，從這個(gè)角度來(lái)看，Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束納米顆?？梢詼p少藥物的過(guò)早釋放，這一特性有益于癌癥的治療.

圖8 DOX負(fù)載的Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束的DOX釋放曲線Fig.8 Drug release profiles of DOX from DOX-loaded Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4

3 結(jié)論

根據(jù)腫瘤組織的pH特異性，設(shè)計(jì)了pH響應(yīng)星狀聚合物Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4. 結(jié)合ROP和ARGET ATRP方法成功合成了分子量分布窄(PDI＜1.30)、結(jié)構(gòu)明確的聚合物. 該聚合物自組裝膠束具有良好的穩(wěn)定性(CMC=3.4 mg/L). 由于PDEAEMA的氨基質(zhì)子化，膠束的粒徑顯示出pH依賴性. DOX的體外釋放結(jié)果表明，當(dāng)pH=7.4時(shí)，藥物的累積釋放量為17%，說(shuō)明膠束可以有效地降低藥物的突釋. 因此，pH響應(yīng)Ad-(PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA)4膠束具有特異性遞送抗癌藥物的潛能.