秸稈纖維素降解菌的篩選及其產(chǎn)酶特性研究

張 悅 ， 季 靜 *， 關(guān)春峰 ， 金 超 ，李 倩 ， 閆 豹 ， 王 罡 ， 王昱蓉

（1. 天津大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2. 天津市天大天福生物技術(shù)有限公司，天津 300384；3. Division of Biological Sciences, University of California San Diego, San Diego, California, USA. ）

秸稈還田是一項(xiàng)多效的農(nóng)業(yè)措施，既可以增強(qiáng)土地肥力又可帶來增產(chǎn)的效果，眾所周知我國是農(nóng)業(yè)第一大國，而且每年生物質(zhì)能源中秸稈資源占50%，但因?yàn)榻到饧夹g(shù)不發(fā)達(dá)、工業(yè)化難度較大、資源利用成本高，使秸稈綜合利用率呈現(xiàn)下降趨勢，所以還田玉米秸稈的腐解成為目前研究的熱點(diǎn)[1]。經(jīng)中國東北及內(nèi)蒙古地區(qū)玉米秸稈還田的研究結(jié)果表明，因?yàn)槎練鉁剌^低且持續(xù)時(shí)間長導(dǎo)致秸稈入土后腐解速度較為緩慢，這不僅會使播種質(zhì)量受到影響，還會導(dǎo)致一些病蟲的滋生，給農(nóng)田生產(chǎn)帶來諸多潛在危害[2]。因此，不僅要實(shí)現(xiàn)玉米秸稈腐化，更要重視秸稈腐解效率的提高。通過微生物菌劑來降解秸稈，不僅能夠讓秸稈高效還田還是該問題的有效解決方法之一[3]。

大部分研究致力于利用單一微生物進(jìn)行秸稈降解，而單一菌株其降解能力有限，所以降解效果并不理想，構(gòu)建復(fù)合菌系就變得越來越重要[4]。有研究表明，復(fù)合霉菌降解和單一菌株對秸稈的降解相比，秸稈的失重率可提高21.3%～59.6%[5]。其中構(gòu)建復(fù)合菌系可以通過單菌株組合法或直接混合法。多數(shù)研究采用后者，通過多代連續(xù)培養(yǎng)來構(gòu)建[6]，而利用不同單菌株的組合來構(gòu)建復(fù)合菌系的相關(guān)研究還較少。但直接混合篩選法存在很多問題，例如菌系中菌株組成種類多會導(dǎo)致對其鑒定困難[7]。但直接組合單菌株的方法其穩(wěn)定性與高質(zhì)量可控，且每種菌株的特性較為清晰明確[8]。

綜上所述，本研究欲從田間腐化的秸稈中篩選并分離單株纖維素降解高效菌株，后通過合理的組合構(gòu)建并優(yōu)化高效復(fù)合菌系。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1供試樣品

供試秸稈樣品為田間腐化玉米秸稈，取樣選取腐化程度較大的玉米秸稈，樣品取得后冷藏備用。

1.1.2培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基：NH4NO31 g；蛋白胨1 g；瓊脂 20 g；蒸餾水1 000 mL；CMC-Na 15 g；KH2PO41 g；Mg2SO4·7H2O 0.5 g；pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體培養(yǎng)基：NH4NO31 g；蛋白胨1 g；蒸餾水1 000 mL；CMC-Na 15 g；KH2PO41 g；Mg2SO4·7H2O 0.5 g；pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

天然秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)液：NH4NO31 g；蛋白胨 1 g；蒸餾水1 000 mL；KH2PO41 g；Mg2SO4·7H2O 0.5 g；pH 6.5，121℃滅菌 20 min。

1.1.3實(shí)驗(yàn)主要試劑

1）濃度為0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 5.0）

A液為0.1 mol/L濃度的檸檬酸鈉溶液：準(zhǔn)確地稱量檸檬酸鈉樣品29 g，將其充分的溶解于無菌的蒸餾水，后移入容量瓶內(nèi)，定容至1 000 mL備用。

B液為0.1 mol/L濃度的檸檬酸溶液：精確地稱取21 g檸檬酸樣品，將其完全溶解于無菌的蒸餾水內(nèi)，再移入容量瓶，定容至1 000 mL備用。

上述步驟準(zhǔn)備完畢后，準(zhǔn)確地稱量295 mL A液（檸檬酸緩沖液），再準(zhǔn)確地稱量205 mL B液（檸檬酸溶液），最終定容于1 000 mL容量瓶。

2）濃度為0.51%的CMC-Na標(biāo)準(zhǔn)溶液

精確地稱取0.51 g CMC-Na樣品，并將樣品置于少量的檸檬酸緩沖溶液中，攪拌混合后于50～70℃的水浴鍋內(nèi)加熱至其完全溶解，待其冷卻后再用檸檬酸緩沖溶液定容至100 mL容量瓶內(nèi)。

3）DNS試劑

準(zhǔn)確地稱0.5 g 3,5-二硝基水楊酸樣品，再配制20 mL濃度為 2 mol/L的NaOH溶液，并準(zhǔn)備50 mL的無菌蒸餾水，將稱取好的3,5-二硝基水楊酸樣品加至NaOH溶液和蒸餾水中，充分的攪拌使其完全的溶解后，再稱取30 g酒石酸鈉樣品，溶解于內(nèi)，待其完全冷卻后，先定容至100 mL容量瓶中，再置于棕色試劑瓶中避光冷藏保存。

4）濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

取少許的葡萄糖樣品加熱烘干至其恒重，再精確地稱取0.1 g已烘干的葡萄糖樣品，用無菌蒸餾水并定容至100 mL容量瓶中，冷藏備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品富集

將采集的腐化秸稈適當(dāng)粉碎后溶于無菌水30℃條件下振蕩7 d，制備成含有秸稈腐化菌的富集液。

1.2.2纖維素降解菌的初篩

稱取1 mL富集液與99 mL無菌水混合，30℃條件下，120 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，靜置30 min取上清液進(jìn)行梯度稀釋。后選取濃度為10-3～10-7的稀釋液接種于CMC-Na固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)篩選，待菌落長出后，分別挑取不同單菌落進(jìn)一步純化。

將不同組合培養(yǎng)獲得的單菌落培養(yǎng)基用剛果紅進(jìn)行染色，此步驟用于對不同菌種對纖維素降解的能力進(jìn)行初步篩選。首先利用1 mg/mL剛果紅染色液染色待測培養(yǎng)基30 min，再用1 mol/L NaCl溶液脫色30 min，觀測透明圈產(chǎn)生效果，以其清晰度與菌落直徑比作為依據(jù)初判其降解能力。

1.2.3菌株的鑒定

1.2.3.1形態(tài)鑒定

觀察菌落形態(tài)，并擴(kuò)增菌液進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.3.2分子生物學(xué)鑒定

進(jìn)行16S rDNA序列鑒定。以菌株的總DNA為模板，上下游引物分別為27F：5?-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3?和1492R：5?CGGCTACCTTGTTACGAC3?，擴(kuò)增菌株的16S rDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)，其體系為：27F和1492R（10 μmol/L）引物各1 μL，DNA 模板2 μL，Mix 25 μL，dd H2O加至50 μL。反應(yīng)條件為：3 min 97℃變性，1 min 97℃變性，1 min 56℃退火，1 min 72℃延伸，30個循環(huán)；5 min 72℃延伸。后將PCR產(chǎn)物送于金唯智生物技術(shù)公司進(jìn)行序列比對測定。

1.2.3.3構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將所測菌株的16S rDNA測序結(jié)果首先在Gen Bank中比對BLAST相似性，后以FASTA的格式下載與其相似度高的基因序列，運(yùn)用軟件MEGA 7.0，通過鄰接法（neighbor-joning, N-J）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[9]。

1.2.4菌間兼容性研究

將菌株兩兩接種于CMC-Na固體培養(yǎng)基上進(jìn)行30℃共培養(yǎng)，3～5 d后，觀察是否有存在拮抗現(xiàn)象。

1.2.5纖維素降解菌系的構(gòu)建

將初步篩選得到的菌種進(jìn)一步接種于液體培養(yǎng)基中，在溫度為30℃、120 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，后進(jìn)行CMC和FPA酶活力測定，作為進(jìn)一步復(fù)篩的依據(jù)。

粗酶液：后續(xù)所用粗酶液獲得于待測液在6 000 r/min條件下離心10 min后的上清液。

酶活力的定義：1個酶活力單位（U/mL）為1 mL酶液在1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)成1 μmol的還原糖含量。

酶活力的計(jì)算方法按照公式（1）進(jìn)行。

式中，X為待測定的酶活力大小，S為還原糖含量，V為粗酶液體積，V1為稀釋后粗酶液的定容體積，V2為待測酶液的體積。

1.2.5.1還原糖法測定纖維素酶活力

1）CMC酶活力大小檢測

分別準(zhǔn)備4支洗凈、干燥的25 mL相同試管，將其中的1支試管作為空白組對照，剩余的3支試管作為待測組備用，取之前配制好的CMC-Na標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別向所有的試管中加入1.5 mL，將所有試管放入50℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行5 min的預(yù)熱，與此同時(shí)預(yù)熱少許粗酶液，預(yù)熱結(jié)束后只向待測組的試管中加入0.5 mL的粗酶液并充分振蕩混勻，再將所有試管置于50℃的水浴鍋中加熱反應(yīng)30 min，待其反應(yīng)結(jié)束后，再向空白組的試管中加入0.5 mL粗酶液，以上所有步驟完成后分別向所有試管中加入3 mL的DNS試劑，再置于沸水水浴鍋中反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速將其冷卻，并用無菌蒸餾水定容至25 mL刻度處。所有反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)至540 nm波長下，利用空白組試管調(diào)零，檢測待測組溶液的吸光度，并根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)一步測定還原糖的含量，計(jì)算CMC酶活力大小。

2）FPA酶活力測定

分別準(zhǔn)備4支洗凈、干燥的25 mL相同試管，將其中的1支試管作為空白組對照，剩余的3支試管作為待測組備用，取之前準(zhǔn)備好的濾紙條，分別向所有的試管中加入0.5 g，將所有試管放入50℃水浴鍋內(nèi)進(jìn)行5 min的預(yù)熱，與此同時(shí)預(yù)熱少許粗酶液，預(yù)熱結(jié)束后只向待測組的試管中加入0.5 mL的粗酶液并充分振蕩混勻，再將所有試管置于50℃的水浴鍋中加熱反應(yīng)30 min，待其反應(yīng)結(jié)束后，再向空白組的試管中加入0.5 mL粗酶液，以上所有步驟完成后分別向所有試管中加入3 mL的DNS試劑，再置于沸水水浴鍋中反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速將其冷卻，并用無菌蒸餾水定容至25 mL刻度處。所有反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)至540 nm波長下，利用空白組試管調(diào)零，檢測待測組溶液的吸光度，并根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)一步測定還原糖的含量，最終計(jì)算FPA酶活力大小。

1.2.5.2繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別準(zhǔn)備6支洗凈、干燥的25 mL相同試管，再量取不同含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及不同含量的無菌蒸餾水，將其混勻于不同試管中，再加入之前配制好的DNS試劑3 mL置于沸水水浴鍋中反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速將其冷卻，并用無菌蒸餾水定容至25 mL刻度處。所有反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)至540 nm波長下，對每組的吸光度進(jìn)行檢測。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，以吸光度大小為縱坐標(biāo)。

1.2.6復(fù)合菌系的產(chǎn)酶條件研究

1.2.6.1菌系產(chǎn)酶受培養(yǎng)時(shí)間的影響

將復(fù)合菌系于30℃，120 r/min下，在CMC-Na液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，每天測定一次CMC、FPA酶活，連續(xù)測定7 d，根據(jù)酶活力大小比對確定復(fù)合菌系的最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

1.2.6.2菌系產(chǎn)酶受培養(yǎng)溫度的影響

分別于 20～45℃之間每隔 5℃設(shè)置一個溫度梯度，將復(fù)合菌系置于設(shè)置好的不同溫度的培養(yǎng)基中，120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，并在上步已經(jīng)確定的最佳產(chǎn)酶時(shí)間進(jìn)行取樣，進(jìn)而對樣品的CMC、FPA 酶活進(jìn)行測定，根據(jù)不同培養(yǎng)溫度所測酶活的變化趨勢確定復(fù)合菌系的最適產(chǎn)酶溫度。

1.2.6.3菌系產(chǎn)酶受pH的影響

分別于4.5～8.5之間，每隔0.5設(shè)置一個pH值梯度，并將復(fù)合菌系置于不同初始pH值的液體培養(yǎng)基中，在上步確定的最適產(chǎn)酶溫度下，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，并在之前已經(jīng)確定的最佳產(chǎn)酶時(shí)間進(jìn)行取樣，進(jìn)而對樣品的 CMC、FPA酶活進(jìn)行測定，根據(jù)不同培養(yǎng)溫度所測酶活的變化趨勢確定復(fù)合菌系的最適產(chǎn)酶pH值。

1.2.6.4菌系產(chǎn)酶受培養(yǎng)基氮源的影響

分別更換將液體培養(yǎng)基的氮源更換(NH4)2SO4，蛋白胨，尿素和KNO3四種，并將復(fù)合菌系置于不同氮源的液體培養(yǎng)基中，在之前確定的最適產(chǎn)酶溫度及最適pH值條件下，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，并在之前已經(jīng)確定的最佳產(chǎn)酶時(shí)間進(jìn)行取樣，進(jìn)而對樣品的 CMC、FPA 酶活進(jìn)行測定，根據(jù)不同培養(yǎng)溫度所測酶活的變化趨勢確定復(fù)合菌系的最適產(chǎn)酶氮源。

1.2.7秸稈降解效果測定

1.2.7.1秸稈降解實(shí)驗(yàn)

研磨烘干玉米秸稈。取20 g與200 mL天然秸稈液體發(fā)酵液混合，以相對于培養(yǎng)液2%的接種量將復(fù)合菌系接種于滅菌后混合發(fā)酵液中，最適培養(yǎng)溫度下120 r/min振蕩培養(yǎng)15 d，后進(jìn)行秸稈降解效果測定。

1.2.7.2降解率測定

本實(shí)驗(yàn)采用失重率測定的方法，將連續(xù)振蕩培養(yǎng)15 d后的培養(yǎng)體系進(jìn)行高溫滅菌，無菌水洗滌剩余干物質(zhì)并烘干，記剩余物的質(zhì)量為 M1（g），記發(fā)酵前物質(zhì)的質(zhì)量為 M0，利用公式（2）進(jìn)行秸稈失重率 D的計(jì)算。

式中，D為待測定的失重率（%），M0為發(fā)酵前的秸稈質(zhì)量（g），M1為發(fā)酵后剩余干物質(zhì)的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素降解菌的初篩

剛果紅染色后所有培養(yǎng)基均獲得大小不同的透明圈，各組透明圈大小對比如圖1所示，透明圈直徑與菌落直徑比值的結(jié)果比較如表1所示。

圖1 透明圈大小對比圖

表1 透明圈直徑與菌落直徑比值大小

由于纖維素可結(jié)合剛果紅染液，故剛果紅染色后復(fù)合物會呈現(xiàn)出紅色。但如果培養(yǎng)基中纖維素類物質(zhì)已經(jīng)被分解，剛果紅則因無可結(jié)合受體而在脫色中被洗滌掉，致其出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈，葉姜瑜等認(rèn)為可通過透明圈是否產(chǎn)生及其大小來判斷產(chǎn)纖維素酶能力是否存在[9]。高榕等提出可利用透明圈直徑和菌落直徑比值來判斷產(chǎn)纖維素能力大小，這種方法也適合于實(shí)踐應(yīng)用中。而后來大量的研究結(jié)果也證實(shí)了其所具備的可參考價(jià)值，并且應(yīng)用于圖 1不同菌系透明圈直徑與菌落直徑對比圖的實(shí)際操作中[10]。根據(jù)表1中的測量結(jié)果對比可以初步判斷不同菌系產(chǎn)纖維素酶活力的大小為：③＞①＞②。

2.2 纖維素高效降解菌的鑒定

2.2.1菌種形態(tài)學(xué)觀察

所得菌株①的菌落生長較為迅速，菌落呈淡粉色且光滑扁平，單個、成對的桿狀菌體，如圖2所示。

圖2 菌株①形態(tài)與鏡檢圖

菌株②生長較為迅速，菌落呈淡白色且小而光滑。利用革蘭氏染液染色后100×油鏡鏡檢顯示其菌液為陰性，且油鏡下可觀察到其形態(tài)為單個、成對或鏈狀菌體，如圖3所示。

圖3 菌株②形態(tài)與鏡檢圖

圖4 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

2.2.2分子生物學(xué)鑒定

分別對菌株①、②進(jìn)行16S rDNA的序列測定，測定后的PCR電泳圖譜如圖4所示。

根據(jù)圖4顯示，熒光條帶約出現(xiàn)在1 200 bp和2 000 bp之間，證明該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果可以滿足后續(xù)進(jìn)一步測定。

2.2.3系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果分析

選取與菌株①相似度均高達(dá)99%的10株參考序列以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（見圖 5），圖中編號JWJX1XCB014即為菌株①，可看出其與Pelomonas.聚集在一起，且相似度達(dá)到99%，故鑒定菌株①屬于：細(xì)菌界－變形桿菌門－β-變形菌綱－伯克氏菌目－叢毛單胞菌科－Pelomonas.屬。

選取與菌株②相似度均高達(dá)99%的10株參考序列以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（見圖6），圖中編號JWN9KMF1014即為菌株②，可看出其與Curvibacter.相似度達(dá)到100%，故鑒定菌株②屬于：細(xì)菌界－變形桿菌門－β-變形菌綱－伯克氏菌目－叢毛單胞菌科－Curvibacter.屬。

圖5 菌株①基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖6 菌株②基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 菌種間的兼容性測定

將篩選出的菌株進(jìn)行拮抗實(shí)驗(yàn)，觀察后得出兩菌株間無明顯拮抗作用。

2.4 纖維素降解菌系的構(gòu)建

2.4.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖7所示。

2.4.2菌株酶活力力的測定

纖維素酶（CMC酶）對纖維素大分子水解生成纖維二糖和三糖的過程有很大影響，因此其可以作為纖維素酶能力強(qiáng)弱的一個重要判斷依據(jù)[11]。

而纖維素酶在以濾紙條為底物進(jìn)行降解時(shí)所體現(xiàn)出的酶活性被稱為 FPA酶活力，由于濾紙中纖維素的結(jié)構(gòu)較為松散，結(jié)晶度和聚合度較低，故降解利用較為容易，所以 FPA酶活力可判斷纖維素酶系的總酶活，不同酶系之間的協(xié)同作用大小既是通過FPA酶活力體現(xiàn)的。

將初篩所取得的3種菌系分別接種到CMC-Na液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，測定纖維素酶活，不同菌系的相關(guān)酶活性比較如表2所示。

圖7 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 不同菌株酶活力大小對比圖

對3種菌系酶活力大小進(jìn)行比較如圖8所示。由兩圖可知同一種酶的活性在不同種菌株間有差別，即使是同一種菌株產(chǎn)各種酶的能力也不一樣，所以不能靠單一的菌種來提供一個完整的纖維素降解酶系，要結(jié)合不同功能比較強(qiáng)的酶協(xié)同作用。綜合表1中透明圈與菌落直徑的比值對比及圖8中不同菌系酶活的大小也可以確定③號菌系的綜合能力較強(qiáng)，故對其培養(yǎng)條件進(jìn)一步研究。

圖8 不同菌系兩種酶活對比圖

圖9 不同培養(yǎng)時(shí)間對菌系酶活的影響

2.5 纖維素高效降解菌系的培養(yǎng)條件優(yōu)化

結(jié)合上述上述初篩與復(fù)篩結(jié)果，選取③號菌系（Comamonadaceae gx.+Comamonadaceae zj.）進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)條件的優(yōu)化探究。

2.5.1不同的培養(yǎng)時(shí)間對菌系產(chǎn)酶影響的測定

根據(jù)圖9可得，不同的培養(yǎng)時(shí)間會對菌系的產(chǎn)酶活力產(chǎn)生很大影響。在整個培養(yǎng)過程中，菌系的產(chǎn)酶活性整體出現(xiàn)先增后減的變化趨勢。在培養(yǎng)初期，菌系的酶活呈現(xiàn)較低狀態(tài)，酶活力大小分別為CMC酶活0.76 U/mL，F(xiàn)PA酶活0.65 U/mL，而菌系的產(chǎn)酶活力隨著其進(jìn)入對數(shù)生長期后明顯升高。培養(yǎng)第4 d，菌系進(jìn)入穩(wěn)定期，其產(chǎn)酶活力達(dá)到峰值，分別為CMC酶活3.62 U/mL及FPA酶活1.85 U/mL。而第4d后，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被不斷消耗，菌系代謝產(chǎn)物也不斷積累，菌系的產(chǎn)酶活力大小整體呈現(xiàn)出下降趨勢。綜上所述，菌系的最佳產(chǎn)酶時(shí)間為培養(yǎng)第4 d，最大酶活力分別為CMC酶活3.62 U/mL，F(xiàn)PA酶活1.85 U/mL。

2.5.2不同培養(yǎng)溫度對菌系產(chǎn)酶的影響

菌系產(chǎn)酶活力受溫度變化的影響較為明顯。酶的催化效率隨溫度的升高而不斷加強(qiáng)，溫度最適時(shí)酶的催化效率最強(qiáng)，而隨著溫度的再度升高會使酶活性降低最終導(dǎo)致變性失活，所以只有確定菌系培養(yǎng)的最適溫度對研究其最大酶活力來說很有必要。菌系產(chǎn)酶活力大小和溫度的關(guān)系如圖10所示。

由圖 10可看出，菌系酶活受溫度影響的整體趨勢表現(xiàn)為：逐漸增強(qiáng)，最適溫度時(shí)達(dá)到最大酶活力，隨著溫度不斷升高呈現(xiàn)下降趨勢。溫度升至35℃時(shí)，酶活力達(dá)到峰值，分別為CMC酶活 3.75 U/mL，F(xiàn)PA酶活1.79 U/mL，之后兩種酶活都隨溫度升高表現(xiàn)為下降趨勢。綜上所述可知，菌系在35℃時(shí)達(dá)到最大酶活，酶活力大小分別為CMC酶活3.75 U/mL，F(xiàn)PA 酶活1.79 U/mL。

圖10 不同菌系酶活受培養(yǎng)溫度的影響對比圖

圖11 菌系酶活受不同初始pH的影響對比圖

2.5.3不同初始pH對菌系產(chǎn)酶的影響

pH值對酶活力大小主要的影響為：破壞其蛋白空間的結(jié)構(gòu)使其活性喪失；影響其活性部位催化基團(tuán)的解離狀態(tài)，導(dǎo)致無法分解底物；影響活性部位結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)，導(dǎo)致無法結(jié)合底物。菌系產(chǎn)酶活性受不同初始pH的影響如圖11所示。

根據(jù)圖11所示，培養(yǎng)基的初始pH值對菌系酶活力大小產(chǎn)生了很大影響。pH值為4.5時(shí)，酶活力分別為CMC酶活0.76 U/mL，而FPA酶活0.63 U/mL，此時(shí)酶活力較低。而當(dāng)pH升至6時(shí)，CMC酶活較大為3.32 U/mL，而CMC酶活在pH為6.5時(shí)達(dá)到峰值3.56 U/mL，由此可得其CMC酶的最適pH范圍為6～6.5，最適pH為6.5。其菌系的FPA酶活也在pH為6.5時(shí)出現(xiàn)峰值1.86 U/mL，pH升至7時(shí)，仍維持相對較高，達(dá)到1.79 U/mL，由此可見菌系的FPA酶最適pH范圍為6.5～7，最適pH為6.5。可見菌系的酶活力大小整體表現(xiàn)為隨著pH值的增大先升高后降低。綜上所述可得：菌系的最適產(chǎn)酶pH范圍為6～7，最適產(chǎn)酶pH為6.5。

2.5.4不同氮源對菌系產(chǎn)酶的影響

氮是核酸和蛋白質(zhì)的主要組成元素，其本身雖不能誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生纖維素酶，但是它對菌體的生長很重要。所以對不同氮源影響菌系產(chǎn)酶的研究是很必要的。本實(shí)驗(yàn)分別以尿素、(NH4)2SO4、蛋白胨和 KNO3作為菌體培養(yǎng)基的唯一氮源進(jìn)行研究，結(jié)果如圖12所示。

通過圖12可知，其他條件相同時(shí)，菌系對(NH4)2SO4和蛋白胨的利用率相對較高，所產(chǎn)酶活力較強(qiáng)。當(dāng)以蛋白胨為唯一氮源培養(yǎng)時(shí)酶活力最高分別為CMC酶活3.83 U/mL，F(xiàn)PA酶活1.77 U/mL，可見菌系的最適氮源為蛋白胨。

圖12 菌系酶活受氮源影響對比圖

圖13 秸稈失重率對比圖

2.6 秸稈降解效果研究

分別將菌株①、②和復(fù)合菌系③的菌液與秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)液混合發(fā)酵，通過秸稈失重率的測定探究各菌系對玉米秸稈降解效果的影響。各組失重率測定情況如圖13所示。

10% NaOH預(yù)處理組進(jìn)行7天預(yù)處理，預(yù)處理后將發(fā)酵液pH值調(diào)至6.5后接菌再發(fā)酵15 d，而無預(yù)處理組則接菌后直接發(fā)酵15 d，后測定各處理組的秸稈失重率。由圖13可知，復(fù)合菌系發(fā)酵的秸稈失重率相交其他兩種單一菌株較高，而復(fù)合菌系的10% NaOH預(yù)處理組秸稈失重率最高，達(dá)到了78.10%，與單一菌種的最大失重率相比分別提高了29.18%和33.23%。綜上所述可知，復(fù)合菌系③的10% NaOH預(yù)處理組降解效果最好。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在纖維素降解菌的初篩過程中，通過對透明圈與菌落直徑比值對比可知，Pelomonas gx.+Curvibacter zj.復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶能力較高，透明圈與菌落直徑比可達(dá)到10.5，而在纖維素高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化中，通過CMC酶活與FPA酶活大小的比較可得出，復(fù)合菌系Pelomonas gx.+Curvibacter zj.在溫度35℃、pH為6.5、蛋白胨為氮源的條件下培養(yǎng)4 d產(chǎn)酶最優(yōu)，產(chǎn)酶能力明顯高于單一菌株，其在結(jié)合化學(xué)預(yù)處理后秸稈降解率最高，秸稈干粉失重率可達(dá)78.10%。

與前人相比，段杰等[5]研究了木霉與青霉屬的復(fù)合菌系降解玉米秸稈，失重率達(dá)34.52%。王海濱等[12]研究了弗留明拜葉林克氏菌等不同細(xì)菌復(fù)合菌系降解玉米秸稈，失重率達(dá)63.10%。本研究所篩兩種菌雖尚未有纖維素降解相關(guān)研究，但其基因序列與假單胞菌屬序列相似度很高，而大量研究表明假單胞菌屬具有纖維素降解功能，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此兩種菌所構(gòu)復(fù)合菌系降解玉米秸稈失重率可達(dá)78.10%，較前人研究降解率均較高。在化學(xué)法預(yù)處理中得出添加10% NaOH溶液對秸稈預(yù)處理降解效果最好的結(jié)論，這與李軼等在試驗(yàn)中添加 10% NaOH溶液后加入綠色木霉的處理方式對秸稈木質(zhì)素的降解效果較好且降解率達(dá)到39.28%的研究結(jié)果一致[13]。

但對于原材料的選擇方面，本研究僅選取玉米秸稈作為實(shí)驗(yàn)原材料，可在以后的研究中適當(dāng)增加材料的選取種類，對其他農(nóng)作物秸稈進(jìn)行有關(guān)研究，以便更好的發(fā)揮其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。