海洋氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶清除甘蔗制糖中右旋糖酐的研究

劉樂，丁一，王淑軍，2，房耀維，呂明生，*

（1.淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院（連云港），江蘇連云港222005）

右旋糖酐（又稱葡聚糖）是以α-1，6糖苷鍵連接為主，側鏈含有 α-1，2、α-1，3、α-1，4 糖苷鍵的大分子多聚糖[1]。隨著分子量增加，右旋糖酐黏性不斷增大[2]。研究表明，制糖過程中絕大部分的糖損失是由微生物污染造成。甘蔗收獲后堆放在糖廠，在溫暖潮濕的環(huán)境下存放14小時后，由于微生物的作用可產(chǎn)生右旋糖酐，其中腸系膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）和乳酸菌（Lactobacillus）是主要的菌群[3-5]。右旋糖酐的產(chǎn)生會導致蔗汁黏度增大、影響沉降速度和清潔效率、旋光度虛假升高等不良后果，對制糖工業(yè)造成經(jīng)濟損失[6]。雖然通過物理方法，如超濾、膜透析和反滲透可以清除右旋糖酐，但經(jīng)濟成本相對較高[7]。目前，在制糖業(yè)中通用的方法是酶解法[8-9]。

右旋糖酐酶可將右旋糖酐水解成低分子量的糖，從而清除甘蔗汁中的右旋糖酐。目前制糖業(yè)中所使用的右旋糖酐酶主要來源于霉菌細麗毛殼菌（Chaetomium gracile）和毛殼菌（Chaetomium erraticum）[10]。霉菌的生產(chǎn)周期較長，酶制備技術存在一定的安全隱患，仍需完善[11-12]。超聲波是一種高強度的聲波能量，在處理加工具有生物功能的大分子上應用廣泛[13]。已有文獻報道，超聲能夠提高酶的催化活性[14]。研究表明，超聲波的氣穴效應會增強酶在底物分子表面運轉，空氣的機械沖擊會使底物與酶更易復合[15]。本研究使用本實驗室保存的海洋氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter oxydans）KQ11右旋糖酐酶對其清除甘蔗汁中右旋糖酐的條件進行了優(yōu)化，為其在制糖生產(chǎn)中的應用提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗：購于當?shù)爻?，將甘蔗榨汁，?jīng)離心機以20 000 g離心20 min，取上清即為甘蔗汁樣品；酵母粉：英國Oxiod公司；右旋糖酐20000、魚粉蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀、苯酚、無水亞硫酸鈉、乙酸：國藥集團化學試劑有限公司（均為分析純）；三氯乙酸、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸：南京化學試劑有限公司（均為分析純）；麥芽糖（生物試劑）：滬式試劑有限公司。右旋糖酐酶：KQ11在25℃，200 r/min，發(fā)酵28h，經(jīng)離心，上清即為粗酶液；KQ11發(fā)酵培養(yǎng)基配方：酵母粉（1.0 g/L）、蛋白胨（5.0 g/L）、MgSO4（0.4g/L）、NaCl（4.0 g/L）、右旋糖酐20 000（10.0 g/L），蒸餾水配置，用NaOH溶液調整pH值至7.5。

MULTIFUGE X3R高速冷凍離心機：美國賽默飛公司；梅特勒臺式pH計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；YP2001電子天平：上海精密科學儀器有限公司；AP-01P真空泵：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Bio-Rad全自動酶標儀：美國Bio-Rad有限公司；UV9000紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器責任有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海一恒科技有限公司；NDJ-1型旋轉式粘度計：上海天平儀器廠；Brason超聲儀：必能信超聲（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 右旋糖酐含量變化

將榨好的甘蔗汁在室溫下暴露于空氣中，自然發(fā)酵10 d，每天用高速冷凍離心機將甘蔗汁以20 000 g離心20 min，測定上清右旋糖酐含量。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 pH值對右旋糖酐清除的影響

量取400 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到8支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH或HCl將pH 值分別調節(jié)至 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，45℃水浴保溫10 min，取出后置于沸水中2 min滅活右旋糖酐酶，冷卻至室溫后測定各組樣品右旋糖酐含量，用公式（1）計算右旋糖酐清除率。

1.2.2.2 反應溫度對右旋糖酐清除的影響

量取400 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到8支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)甘蔗汁pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液。設置水浴溫度分別為35、40、45、50、55、60、65、70℃，保溫10 min。之后操作與1.2.2.1同。

1.2.2.3 反應時間對右旋糖酐清除的影響

量取400 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到8支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁加入0.1U的右旋糖酐酶液。置于 45 ℃水浴鍋中分別水浴中保溫 5、10、15、20、25、30、35、40 min。之后操作與 1.2.2.1 同。

1.2.2.4 酶添加量對右旋糖酐清除的影響

量取300 mL甘蔗汁樣品，平均分裝到6支錐形瓶中，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至6.0，按每毫升甘蔗汁分別加入0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.2 U的右旋糖酐酶液，置于45℃水浴中保溫10 min。之后操作與1.2.2.1同。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對右旋糖酐酶清除甘蔗汁中右旋糖酐最佳反應條件進行優(yōu)化，正交試驗表見表1。

表1 L9（34）正交試驗表Table 1L9（34）horizontal orthogonal experiment

1.2.4 超聲對清除右旋糖酐的影響

1.2.4.1 超聲時間

量取甘蔗汁樣品200 mL，測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至6.5，平均分裝到4支錐形瓶，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，置于超聲波儀中，反應溫度50℃，功率300 W，分別超聲1、5、10、15 min，之后操作與 1.2.2.1 同。

1.2.4.2 超聲功率

量取甘蔗汁樣品150 mL，用快速掃描檢測法測定右旋糖酐含量，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)pH值至6.5，平均分裝到3支錐形瓶，按每毫升甘蔗汁加入0.1U右旋糖酐酶液，置于超聲波儀中，反應溫度50℃，超聲功率分別設置為 200、400、600 W，超聲/間歇時間 3 s/3 s，準確超聲15 min。待蔗汁溫度降至25℃，測定其黏度，操作同1.2.1。之后操作與1.2.2.1同。

1.2.5 右旋糖酐含量測定

采用快速掃描檢測法[16]。右旋糖酐能夠與無水乙醇作用，在OD720處有最大吸收峰。用右旋糖酐標準溶液測定并繪制右旋糖酐標準曲線。以右旋糖酐含量（C：mg/L）對吸光度（A）進行線性回歸，回歸方程為：A=0.001 8C+0.006 7（R2=0.999 6）

1.2.6 右旋糖酐清除率的計算

1.2.7 酶活測定

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法繪制麥芽糖標準曲線，并測定待測樣品酶活。以麥芽糖的含量（C：mg/mL）對吸光度（A）進行線性回歸，回歸方程為：A=0.499 5C+0.064 4（R2=0.999 2）。

1.2.8 黏度測定

將待測甘蔗汁加入到NDJ-1型旋轉式黏度計的0號轉子中，保持溫度在25℃穩(wěn)定后，啟動黏度計使轉子轉速在60 r/min，觀察黏度計表盤讀數(shù)，將讀數(shù)代入公式 η=κ·α，式中：η 為絕對黏度，mPa·s；κ 為黏度系數(shù)；α為指針所指讀數(shù)。分別測定最優(yōu)條件處理前與處理后蔗汁的黏度。

2 結果與分析

2.1 右旋糖酐含量變化

室溫下（25℃）甘蔗汁中右旋糖酐含量的變化見圖1。

如圖1，在室溫下（25℃），微生物會消耗蔗糖生成右旋糖酐，右旋糖酐含量平均每天增加8.67 mg/L，平均每天增長率為4.3%。這會導致制糖企業(yè)在生產(chǎn)過程中糖回收率降低，產(chǎn)品質量下降。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值對右旋糖酐清除的影響

本試驗中，酶劑量0.1 U/mL甘蔗汁，反應溫度45℃，反應時間10 min。在pH 4.5～6.0，右旋糖酐清除率穩(wěn)定而緩慢增加，當pH值高于6.5時，右旋糖酐清除率顯著下降，見圖2。

圖1 室溫下甘蔗汁中右旋糖酐含量的變化Fig.1 Changes of dextran content in sugarcane juice at room temperature

圖2 pH值對右旋糖酐清除率的影響Fig.2 Effect of pH value on the ratio of hydrolysis of dextran

新鮮甘蔗汁的pH值為中性，微生物生長則造成甘蔗汁中右旋糖酐含量增加和pH值降低，制糖企業(yè)中，甘蔗汁進行過濾澄清之前，pH值為5.0～6.0[5]。微酸條件不影響氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶對右旋糖酐的清除作用。

2.2.2 反應溫度對清除右旋糖酐的影響

反應溫度為35℃～60℃，右旋糖酐清除率相對穩(wěn)定，在45℃時，達到最高，清除率為81.4%。反應溫度高于65℃時，右旋糖酐清除率迅速下降，見圖3。

當反應溫度高于65℃時，右旋糖酐酶變性失活，然而，甘蔗汁存放以及早期處理過程的溫度為20℃～40℃。氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶可滿足制糖工藝中甘蔗汁前處理階段的溫度要求。

2.2.3 反應時間對清除右旋糖酐的影響

反應時間對右旋糖酐清除率的影響見圖4。

如圖4，在5 min～40 min反應時間內，右旋糖酐清除率保持穩(wěn)定，反應5 min，右旋糖酐酶即可有效清除甘蔗汁中的右旋糖酐。淡紫色擬青霉（Paecilomyceslilacinus）右旋糖酐酶在30℃，反應24 h，可清除70%的右旋糖酐[15]，而本研究所用的右旋糖酐酶反應5 min即可達到70%的清除率，極大節(jié)約了時間成本。

2.2.4 酶劑量對清除右旋糖酐的影響

酶劑量為0.02 U/mL～0.10 U/mL甘蔗汁時，隨著酶劑量增加，右旋糖酐清除率不斷提高。當酶劑量為0.1U/mL甘蔗汁時，右旋糖酐清除率最高，達到80.15%，見圖5。

最優(yōu)的酶含量可加速酶解反應，但是當繼續(xù)增加酶的含量時，水解率不會進一步提高。甘蔗汁的黏度可能阻止了右旋糖酐酶與底物的相互作用。

圖3 溫度對右旋糖酐清除率的影響Fig.3 The effect of temperature on the ratio of hydrolysis of dextran

圖4 反應時間對右旋糖酐清除率的影響Fig.4 The effect of reaction time on the ratio of hydrolysis of dextran

2.3 正交試驗

正交試驗結果分析見表2。

根據(jù)表2的極差分析，影響右旋糖酐水解的因素主次為酶劑量＞反應溫度＞pH值＞反應時間。右旋糖酐酶水解甘蔗汁中右旋糖酐的最優(yōu)條件：酶劑量0.10 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反應溫度50℃、反應時間20 min。在該條件下，可以清除甘蔗汁中83%的右旋糖酐。因此，海洋細菌KQ11右旋糖酐酶在制糖工業(yè)中具有應用潛力。

圖5 酶劑量對右旋糖酐清除率的影響Fig.5 The influence of enzyme dosage on the ratio of hydrolysis of dextran

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment

2.4 超聲對清除右旋糖酐的研究

超聲時間對右旋糖酐清除率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對右旋糖酐清除率的影響Fig.6 The influence of ultrasonic power on the hydrolysis of dextran

由圖6可知，超聲處理對右旋糖酐酶清除右旋糖酐的效果十分顯著。在酶劑量0.10 U/mL甘蔗汁，pH 6.5，反應溫度50℃，超聲功率300 W的條件下處理1 min就可清除81.3%的右旋糖酐，當在該條件下處理5 min，清除率達到了85%，比正交試驗的最優(yōu)條件清除率更高，所用時間更短。當超聲輔助處理15 min，右旋糖酐清除率達到87.1%，比正交試驗的結果提高了4.1%。超聲功率對右旋糖酐清除率的影響見圖7。

圖7 超聲功率對右旋糖酐清除率的影響Fig.7 The influence of ultrasonic time on the hydrolysis of dextran

如圖7所示，超聲功率對清除右旋糖酐的影響非常明顯。600W處理15min時的清除率遠高于200W和400 W，為88.7%，比正交試驗的清除率提高了5.7%。經(jīng)檢測，此時甘蔗汁黏度為4.0 mPa·s，而處理前甘蔗汁粘度為5.0 mPa·s，降低了20%。超聲能夠促進右旋糖酐酶與底物的結合，而不影響酶的活性[5]。建議在甘蔗制糖企業(yè)的前處理工序安裝超聲變幅桿。

3 結論

海洋氧化節(jié)桿菌KQ11右旋糖酐酶能夠清除甘蔗汁中右旋糖酐。清除右旋糖酐的最優(yōu)條件如下：酶劑量0.1 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反應溫度50℃、反應時間20 min。在該條件下可以清除83%的右旋糖酐。超聲可以提高右旋糖酐清除率。在酶劑量0.10 U/mL甘蔗汁、pH 6.5、反應溫度50℃、超聲功率600 W、超聲時間15 min的條件下，右旋糖酐清除率可達到88.7%，甘蔗汁粘度降低20%。目前商業(yè)化的右旋糖酐酶主要來自國外進口，價格昂貴。一些研究者通過甲醇誘導畢赤酵母工程菌獲得外源右旋糖酐酶。但是甲醇是易燃易爆物，存在安全隱患，而且甲醇具有毒性，作為誘導劑加入發(fā)酵液會在產(chǎn)物中殘留，增加處理和檢測成本。海洋細菌KQ11發(fā)酵簡單，生產(chǎn)安全，無需加入有害誘導劑，對環(huán)境溫和。海洋細菌KQ11右旋糖酐酶與超聲聯(lián)合使用的方法在清除甘蔗汁中右旋糖酐的效果上有著明顯優(yōu)勢，安全無害，清除率更高，作用時間更短。建議在糖廠制糖壓榨甘蔗汁階段可使用海洋細菌KQ11右旋糖酐酶，同時安裝超聲變幅桿，增設超聲處理。本研究為右旋糖酐酶在制糖工業(yè)上的應用提供了參考。