乳鐵蛋白分離純化研究進展

張基亮，張?zhí)m威，2，*，韓雪，馬鶯

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266100）

乳鐵蛋白（lactoferrin，Lf）早在1939年就被分離得到，是一種“紅色蛋白”，隨后對其研究表明，該蛋白的分子量大約為80 kDa，是一種非血紅素轉(zhuǎn)鐵蛋白，與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白共同組成了轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。Lf是由人、牛、羊和馬等的上皮細胞分泌產(chǎn)生，多存在于乳和淚等分泌物中[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Lf是一種多功能性的糖蛋白，其生物學(xué)性質(zhì)包括抗微生物性、抗炎性、抗癌性、免疫調(diào)節(jié)性和酶活性等[2]。因此，Lf被廣泛應(yīng)用于保健食品、配方奶粉、醫(yī)藥等領(lǐng)域中。Lf既可以來自乳汁，又可以來自工業(yè)廢液乳清。由于Lf的含量少，需求量大，所以高效分離純化對于Lf的應(yīng)用有著重要的意義，也是解決限制其應(yīng)用的瓶頸。

1 乳鐵蛋白的分離純化的傳統(tǒng)方法

純化Lf的方法有許多種，許多生產(chǎn)公司選擇陽離子交換色譜系統(tǒng)來大范圍的獲得Lf。對Lf的分離純化開始于上世紀80年代，許多公司都致力于開發(fā)獲得高純度Lf的工藝。據(jù)估計，世界的牛Lf的產(chǎn)量超過60 t/年[3]。對Lf分離純化方法從最初的陽離子交換到親和層析再到免疫學(xué)方法，以及各種方法的組合對于分離及純化Lf都各有利弊。

1.1 陽離子交換色譜

利用陽離子交換色譜從原料中分離獲得Lf是傳統(tǒng)的方法，其優(yōu)點是操作簡單、步驟少、持續(xù)進樣和容易擴大等優(yōu)點。但是，傳統(tǒng)色譜層析用于快速的和大量的從乳清蛋白中回收Lf時表現(xiàn)出很多的缺點，如色譜層析材料的污染、循環(huán)時間長、液滴通過色譜柱時壓力大以及復(fù)雜的控制系統(tǒng)，而且原料中許多與Lf帶有相同電荷及相似等電點的雜蛋白在分離純化Lf時被一同洗脫下來，所以獲得的Lf純度低、費用昂貴和相對低的產(chǎn)量。造成這些缺點的原因是用于分離的乳清體積大和蛋白濃度高導(dǎo)，使其單獨應(yīng)用于Lf的回收時受到限制。然而，與其他方法的結(jié)合可以部分解決其限制因素[4]。

Conan J Fee等[4]用XK16色譜柱和瓊脂糖凝膠填料，以全脂乳或未經(jīng)任何處理的原料乳為原料，一步法同時獲得Lf及乳過氧化物酶（lactoperoxidase，Lp），且最佳的吸附能力為48.6 mg/mL。

1.2 膜吸附

膜吸附技術(shù)通過過濾吸附過程為從乳清中回收蛋白提供了一個可能性。該技術(shù)通過將色譜分離和過濾相結(jié)合，可以將具有功能性的基團附著到大孔膜的內(nèi)部表面，使膜轉(zhuǎn)換成高效的吸附材料。因此，根據(jù)不同的需要選擇不同的功能性基團來達到不同的分離目的，如離子交換和配體系統(tǒng)等。商業(yè)上可用于實驗室和大規(guī)模的膜系統(tǒng)是離子交換系統(tǒng)和強酸型（磺酸）、強堿型（季銨）、弱酸型（羧酸）和弱堿型（乙二胺）[5]?，F(xiàn)在用于工業(yè)化生產(chǎn)的膜吸附技術(shù)被設(shè)計成了二次過濾和濃縮方法的結(jié)合。然而，這個過程需要極其大量的水來有效的分離生物大分子，產(chǎn)品的回收率取決于緩沖液的體積，而且不能區(qū)分分子量相似的蛋白。因此，使得該技術(shù)在分離純化蛋白時步驟多、回收率低、另外不同組成的乳清蛋白使得純化過程的預(yù)測性變得復(fù)雜、選擇性低和隨時間延長的膜堵塞等缺點[6]。

為改善膜技術(shù)的諸多不利，切向流過濾膜被開發(fā)出來，該技術(shù)是基于交叉流體動力學(xué)，由于在每個膜上所需的底板面積小，減少了壓力驅(qū)動力并且降低了滲透通量，整個操作所需的壓力更低。因此，可以降低膜堵塞的程度，延長使用時間從而達到快速分離的目的[7]。由于Lf的熱穩(wěn)定性差，而膜分離是一個不需加熱，沒有相變并且不需要化學(xué)試劑的分離過程。因此，該方法可以最大限度的保持Lf的生物活性，使之成為分離回收Lf的一個優(yōu)勢。

Kerstin Plate等[5]研究是否能利用膜技術(shù)將乳清中Lf回收以及實驗室水平的設(shè)備是否可以直接應(yīng)用于工業(yè)化。試驗用的膜面積從15 cm2上升到4 m2，其試驗結(jié)果表明，最佳條件是選用Sartobind S系統(tǒng)，膜面積擴大到2 m2，8個循環(huán)不用清洗。Almécija等[8]使用300 kDa的陶瓷微孔膜從乳清中分離Lf，研究表明，獲得Lf最佳的溶液pH值分別為pH 5和pH 10，前者可以獲得Lf，而后者可以使Lf滯留在原乳清中。為了克服膜吸附無法區(qū)分近似分子量的弊端，Brisson等[9]使用荷電膜和電場的結(jié)合，電場使蛋白的移動起到了重要的作用，雖然解決了一部分純度問題，但是溶液表面發(fā)生的電解反應(yīng)對于Lf的分離起到了負面的影響。

1.3 膠質(zhì)氣體泡沫

膠質(zhì)氣體泡沫（colloidal gas aphrons，CGAs）由表面活性劑溶液強烈攪拌由氣體內(nèi)部核心所圍成的微泡，通過靜電相互作用和疏水相互作用吸附分子。其在分離生物大分子上具有很好的特點，諸如：（1）由于其體積小而具有大的界面面積；（2）相對穩(wěn)定，當其形成后，一旦停止攪拌，CGAs在不需要外力的幫助下數(shù)分鐘內(nèi)分離成兩相；（3）表面特點和吸附的選擇性可以通過改變表面活性劑的類型而改變。研究發(fā)現(xiàn)，離子型表面活性劑比非離子表面活性劑具有更高的蛋白富集和回收效果[10]。

E Fuda等[10]研究分離乳清蛋白時發(fā)現(xiàn)，陰離子表面活性劑雙（2-乙基己基）琥珀酸酯磺酸鈉（sodium bis-2-ethylhexyl sulfosuccinate，AOT） 形成的 CGAs適用于分離乳清中的Lf和Lp，而通過改變pH值和等電點可以使Lf和Lp分散在上層的泡沫相和下層的液相中，實現(xiàn)蛋白分離的目的；而陽離子（溴化十六烷基三甲銨）膠質(zhì)氣體泡沫適用于分離乳清中的β-乳球蛋白，其中靜電相互作用是決定選擇性的主要作用力。該技術(shù)具有可連續(xù)操作、表面積大、可通過改變表面活性劑的類型所修飾、相對穩(wěn)定性高和分離時間短等特性，但選擇性相對較低。

1.4 模擬移動床

模擬移動床是基于模擬一個真正的在固相和液相之間反流操作。通過閥門間的切換使柱子間像木馬一樣換位。反流操作使得吸附劑的使用更有效并且液體流會帶來許多優(yōu)勢，如高生產(chǎn)率、費用低、分離裝置小、產(chǎn)品濃度高、減少緩沖液的消耗、對原材料的使用效率更高和高純度產(chǎn)品是其的一些優(yōu)勢，其中最吸引人的優(yōu)勢是可以使用不經(jīng)離心去脂肪的原料奶。其弊端是不同的對象需要不同相關(guān)的流速，并且流速非常緩慢；另一個弊端就是由于各柱間一系列的連接使得比普通的色譜液體壓力大很多，其數(shù)學(xué)模型太復(fù)雜，不易弄明白[11]。

Jonatan Andersson等[11]利用此技術(shù)對Lf的試驗結(jié)果表明，相對無移動床過程來說，移動床在生產(chǎn)效率上提高了48%，節(jié)省6.5倍的緩沖液，目標蛋白的得率提高4.8倍。

1.5 電分離

電分離技術(shù)是利用分子大小和其自身所帶電荷的不同對蛋白分子進行分離的技術(shù)，電流可以使得分離速度加快。與傳統(tǒng)壓力驅(qū)動方法相比，電場的應(yīng)用的優(yōu)勢在于提高了Lf分離的速度，但同時降低了其純度，原因是由于在分離Lf的同時其他乳清蛋白的遷移和蛋白間相互作用。電分離與微濾膜結(jié)合可以克服低選擇性和溶液污染等不足。

N Ndiaye等[12]利用此方法對Lf進行了分離，Lf的最佳分離條件為pH 3.0，以2 g/L的KCl溶液為溶液時，其最佳條件為1.5×10-8m2/（V·s）；以去離子水為溶液時，其最佳條件為3.0×10-8m2/（V·s）。結(jié)合500 kDa的超濾膜，經(jīng)過4 h的處理后，遷移率達到46%，產(chǎn)量為15%。該方法的不足是，在pH 3.0的時候，β-乳球蛋白也會一同被分離出來。

2 乳鐵蛋白的分離純化的新方法

由于Lf的廣泛應(yīng)用，人們對其純度的要求越來越高，但乳清中的一些蛋白如乳過氧化物酶，該蛋白和Lf具有相似分子量和等電點。另外，一些學(xué)者還指出Lf結(jié)合蛋白在純化Lf的同時也被純化，其中包括核糖核酸酶-4、血管生長素、嗜中性粒細胞凝膠酶相關(guān)鈣脂蛋白和成纖維細胞生長因子結(jié)合蛋白等。這些微量蛋白與Lf可能涉及到許多Lf體內(nèi)功能多樣性的生理學(xué)活性[13]。常規(guī)的疏水相互作用、親和色譜、分子排阻、超濾和膜超濾等過程復(fù)雜，加之選擇性低，因此一些選擇性高的方法被開發(fā)出來。

2.1 羥磷灰石法

Paul K Ng等[14]使用一種混合模式色譜-陶瓷羥磷灰石層析。該方法可以一步將乳清中的Lf、Lp和其他球蛋白都分離，然后通過梯度洗脫獲得Lf。試驗結(jié)果表明，一個80 L的羥磷灰石柱一小時可收集0.32 kg的Lf，得到的Lf經(jīng)驗證不含任何的Lp活性。產(chǎn)量高、費用低和步驟簡單使得該操作具備所有的用于有效地大規(guī)模生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)特點。羥磷灰石純化過程需要大量的水來有效地分離大分子，產(chǎn)品回收率依賴于使用緩沖液的量、該方法沒有辦法區(qū)分具有相似水合粒徑的分子，因此產(chǎn)品的純度可能會受到影響。另外，乳清中不同的蛋白間相互作用使得該過程很難預(yù)測。

2.2 噬菌體蛋白-親和色譜

親和柱一般是基于抗原抗體反應(yīng)，具有特異結(jié)合的配體被廣泛應(yīng)用于不同的分離純化目的。親和柱的選擇性高有利于獲得純度高的蛋白，然而配體本身昂貴、根據(jù)分離不同的目的蛋白，配體本身需要重新進行篩選和純化、配體的易碎性降低了柱的使用壽命、配體降解導(dǎo)致終產(chǎn)品的污染以及染料配體的泄露和毒性問題是限制其應(yīng)用的原因。

噬菌體作為多肽配體的表達者，其譜庫量大并且針對諸如Lf、胰島素和血清白蛋白等的噬菌體已經(jīng)成功的被選育。親和色譜中的肽配體可以用常規(guī)的方法或者固相直接合成法固定于基質(zhì)上，用于目的蛋白的分離純化。人工合成的多肽與宿主表達的多肽往往表現(xiàn)出不同的性能，因此Wim Noppe等[15]成功選育出了4株表達能夠結(jié)合Lf六肽的噬菌體，然后將長度1 μm噬菌體直接固定化到大孔基質(zhì)上用于Lf的分離純化。其試驗表明，利用該親和方法可以一步法提取Lf，且其純度高于95%。該方法的優(yōu)點是基質(zhì)孔洞不易堵塞、操作過程簡單、可持續(xù)性、回收速度快。且噬菌體表達相比單克隆抗體要便宜及步驟簡單。

2.3 磁性納米粒子

磁性納米粒子用于分離Lf的好處在于，當外加電場時，磁性納米粒子瞬間帶有磁性，可以在電場作用下泳動。當撤去外加電場時，磁性立即消失，這樣有利于磁性納米粒子的分離，再配合以膜等技術(shù)，最終獲得目的蛋白。

Bo-Hung Lai等[16]將伴刀豆蛋白A結(jié)合在Fe3O4磁性納米粒子上，獲得了平均直徑為（11.74±3.86）nm的近超順磁性粒子。經(jīng)過試驗證明，該粒子在分離Lf時的最佳條件為pH值=7，溫度25℃，平衡時間在5 min之內(nèi)，最大吸附能力和平衡常數(shù)分別是59.2 mg/g和0.010 3 L/mg。

Lin Chen等[17]以肝素作為親和配體，用磁性親和方法分離Lf，肝素在對于Lf的結(jié)合能力為0.92 mg/g。試驗以NaCl作為洗脫液，通過一步法非常高效地從酸性乳清中回收Lf，最高的結(jié)合能力是164 mg/g。且獲得的Lf的純度要高于商業(yè)標準。通過對比競爭吸附試驗證明磁性方法是一種潛在的能夠快速和大規(guī)模生產(chǎn)方法。

2.4 離子液體-水兩相系統(tǒng)

離子液體-水兩相系統(tǒng)為新穎的分離過程可以克服常規(guī)分離和純化Lf技術(shù)的限制，其組成特點是通過散裝膜與U型管的組合來完成試驗用的分離裝置，U型管的一側(cè)上方為水相，含有待分離的目的蛋白；另一側(cè)上方為水相；U型管的底部為離子液體相，離子液體相與水相之間用膜分隔開。使蛋白通過相轉(zhuǎn)變而完成分離工作。離子液體-水兩相系統(tǒng)的優(yōu)點是，溫和的相容性環(huán)境、提取率高、相分離快速和相對低的黏性；缺點是容易互溶，使得分離和回收離子溶液變的復(fù)雜。

Enrique Alvarez-Guerra等[18]利用兩種咪唑類作為離子液體進行研究，分別為1-丁基-3-甲基咪唑雙[（三氟甲基）磺?；鵠酰亞胺（1-butyl-3-methylimidazolium bis[（trifluoromethyl）sulfonyl]imide，BmimNTf2）和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，BmimPF6）。試驗結(jié)果表明，最高效的試驗條件為：蛋白濃度含量為100 mg/L、pH 6.4～8.2和低離子強度0.03 mol/L時提取率達到20%。最好的粒子液體為BmimNTf2，原因在于，雖然BmimNTf2的分離效果沒有BmimPF6的效果好，但前者較后者更加穩(wěn)定、不易溶于水以及對牛血清白蛋白的吸附能力極小，因此前者更利于Lf的分離。

3 方法的結(jié)合

3.1 陽離子交換與膜結(jié)合

在使用陽離子交換或膜分離Lf時，由于陽離子交換不能區(qū)分相似pH值的蛋白質(zhì)以及膜分離不能區(qū)分相似分子量蛋白的影響。因此，使兩種方法單獨使用時獲得的Lf的純度不高。二者聯(lián)用同時減少了兩者分離蛋白的局限性。

吸附膜的準備一般分為3步，基本膜的準備、化學(xué)激活基本膜和連接配體激活膜。后2步需要強烈的化學(xué)試劑和物理情況可導(dǎo)致不希望的及不可逆的膜結(jié)構(gòu)變化。而混合基質(zhì)膜色譜是一個理想的替代，由離子交換樹脂在膜鑄造前合并到高分子膜內(nèi)，因此合并吸附配體化學(xué)修飾的必要性與膜準備過程不偶聯(lián)。

Mian bin Wu等[19]利用色譜和膜結(jié)合的方法可以同時分離Lf和免疫球蛋白G，并且純度分別是95.0%和96.6%。但回收率相對較低分別為68.83%和45.38%。

Syed M Saufi等[20]通過將SP Sepharose陽離子交換樹脂嵌入到乙烯-乙烯醇聚合物膜中來提取Lf。該技術(shù)對靜態(tài)Lf結(jié)合能力為384 mg/g或者155 mg/mL。Lf的純度可達到91%，進樣速率50 L/（m2·h），運行的滲透通量率為100 L/（m2·h），整體柱中物質(zhì)傳輸主要是依據(jù)對流，短的整體柱可以提高分離速度的同時降低反壓、非特異性結(jié)合、產(chǎn)物降解等。

Lu等[7]通過超濾牛初乳分離得到Lf，然后通過快流速的陽離子交換色譜系統(tǒng)將其純化。其中超濾過程由兩部分組成，第一部分由常規(guī)的100 kDa截留的膜配合以5 m/s的切向流速組成，第二部分則是將膜截留的分子量換成10 kDa配合4 m/s的切向流速。通過該種方法的組合，最終獲得Lf的純度為94.20%，Lf的回收率為82.46%。

3.2 液相色譜與膜結(jié)合

膜色譜用于蛋白純化是將膜過濾和液相色譜整合到一起，進而形成一步的操作步驟。膜色譜比傳統(tǒng)樹脂色譜的優(yōu)勢主要在于其擴散時間短，因為分子間和膜上活性位點間的相互作用在孔之間是通過對流作用發(fā)生的，而不是傳統(tǒng)的吸附粒子孔中的滯留液體作用。因此，膜色譜既可用于高流量又可用于低擴散度的生物大分子，同時還可以減少大分子降解和變性。另外，由于其液壓低以及流速快，減少其在分離純化過程中所用的緩沖液量[21]。

研究報道，使用該結(jié)合方法從甜乳清中分離Lf，Lf分別通過0.1、0.2、1 mol/L NaCl洗脫獲得，其純度可以達到95%。將該膜面積從15 cm2增加到4 m2后，可以使Lf的回收率達到90%以上。但本身存在一個缺點，當將流速從3 mL/min提高到15 mL/min時，其結(jié)合能力從0.6 mg/cm2下降到0.3 mg/cm2[21]。

4 結(jié)論

Lf純化的研究取得了相當大的進步，由于Lf的含量極少，且組成乳的蛋白種類較多，想要低成本的獲得高純度的Lf還需要近一步的研究，希望本文會對今后Lf的分離純化給予更多的新思路。