術(shù)前細(xì)針穿刺洗脫液甲狀腺球蛋白在診斷甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用及影響因素

汪佳慧 高力 壽金朵 蔣賢鋒 張慕蕊 周衛(wèi)萍

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）約占甲狀腺癌的75%～85%，且有高達(dá)30%～80%的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率［1］。因此術(shù)前對頸部淋巴結(jié)的精確評估有利于確定合適的治療方案和手術(shù)方式。超聲及超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺（fine-needle aspiration，F(xiàn)NA）細(xì)胞學(xué)檢查一直是定性診斷可疑腫大淋巴結(jié)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但存在6%～8%的假陰性率，且該方法與操作者及病理科醫(yī)生水平有關(guān)［2］。細(xì)針穿刺洗脫液甲狀腺球蛋白（washout fluid thyroglobulin in fineneedle aspiration，F(xiàn)NA-Tg）是一項較新的技術(shù)，多項研究證實其可以增加診斷甲狀腺癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性［3-6］。因此，最新的美國甲狀腺協(xié)會（American Thyroid Association，ATA）指南推薦其作為甲狀腺癌頸部淋巴結(jié)性質(zhì)判斷的輔助檢測方法［1］。然而，由于FNA-Tg最佳診斷閾值的不確定以及一些可能影響因素的存在，具有一定爭議，限制其在臨床中的應(yīng)用價值，尤其對于甲狀腺全切術(shù)前的患者。本研究旨在尋找甲狀腺全切術(shù)前患者FNA-Tg的最佳診斷閾值，比較其與FNA及兩者聯(lián)合法的診斷效能，同時進(jìn)一步探討淋巴結(jié)解剖學(xué)分區(qū)及血清促甲狀腺素（TSH）、血清甲狀腺球蛋白（serum Tg，sTg）、血清甲狀腺球蛋白抗體（serum TgAb，sTgAb）等相關(guān)實驗室指標(biāo)等對診斷準(zhǔn)確性的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2015年9月至2016年12月于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院手術(shù)病理診斷為PTC的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)后組織病理證實原發(fā)灶為PTC；2）所有淋巴結(jié)穿刺均在術(shù)前進(jìn)行；3）臨床資料完整，包括術(shù)前及術(shù)后隨訪超聲檢查、FNA細(xì)胞學(xué)病理、手術(shù)病理、術(shù)前FNA-Tg及相關(guān)實驗室檢查；4）隨訪時間≥12個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）同時患有其他嚴(yán)重并發(fā)癥；2）病理結(jié)果證實原發(fā)灶為非PTC或其他腫瘤轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)；3）既往甲狀腺術(shù)后患者；4）臨床資料不完整；5）隨訪時間不足。最終共入組患者131例，其中男性44例，女性87例，年齡11～78歲，平均年齡（42.9±12.95）歲。共計267枚可疑腫大淋巴結(jié)納入本研究。

1.2 方法

1.2.1 儀器與方法 采用GE Logiq E9及Philips iU 22型超聲診斷儀，探頭L12-5，頻率5～12 MHz。評估術(shù)前可疑淋巴結(jié)超聲征象：淋巴結(jié)形態(tài)呈圓形、類圓形等不規(guī)則形狀；回聲不均勻，伴有局部性的回聲增高或降低；囊性病變或者鈣化；淋巴結(jié)門結(jié)構(gòu)缺失；融合的淋巴結(jié)；周圍血流信號增多。滿足以上可疑征象之一即定為可疑淋巴結(jié)。頸部淋巴結(jié)的分區(qū)參考2008年美國頭頸外科學(xué)會及美國耳鼻咽喉頭頸外科基金會提出的分組標(biāo)準(zhǔn)［7］。超聲引導(dǎo)下FNA及FNA-Tg測定：穿刺前仔細(xì)詢問病史和體格檢查，排除不適宜或不能耐受穿刺的患者。術(shù)前完善凝血功能等相關(guān)檢查，告知患者相關(guān)風(fēng)險后簽署知情同意書。手術(shù)由具備熟練超聲檢查及穿刺操作經(jīng)驗的高年資醫(yī)師進(jìn)行。患者取仰臥位，頸部墊高，充分暴露。常規(guī)消毒鋪巾，1%利多卡因局部麻醉，選用22-23G細(xì)胞穿刺針。超聲引導(dǎo)下將穿刺針刺入淋巴結(jié)內(nèi)可疑異常區(qū)域，反復(fù)旋轉(zhuǎn)提插，之后拔出穿刺針，將針芯里的穿刺物涂片并立即固定于95%乙醇中，送細(xì)胞病理學(xué)檢查。穿刺完畢后局部按壓30 min。根據(jù)穿刺涂片質(zhì)量決定穿刺針數(shù)，保證每枚淋巴結(jié)至少穿刺3次。同時用1 mL針筒吸取0.5 mL生理鹽水，將穿刺針進(jìn)行沖洗，制成約1.5 mL的洗脫液送檢。采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測FNA-Tg含量。FNA及FNA-Tg結(jié)果的判定：FNA細(xì)胞學(xué)及洗脫液在送檢前需注明穿刺淋巴結(jié)的解剖分區(qū)。涂片經(jīng)H&E染色后由3名高年資細(xì)胞病理科醫(yī)師閱片。將細(xì)胞病理學(xué)檢查明確發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞定為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性，而未檢出癌細(xì)胞定為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性。細(xì)胞形態(tài)可疑惡性定為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可疑，而細(xì)胞量不足或者嚴(yán)重血污染等情況定為穿刺不滿意。目標(biāo)淋巴結(jié)均于手術(shù)皮膚切開前在超聲定位下用醫(yī)用美藍(lán)標(biāo)記。

1.2.2 資料收集及隨訪 收集術(shù)前TSH、sTg、sTgAb等相關(guān)實驗室指標(biāo)，均采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。由于本院可檢驗的最高Tg濃度為480 ng/mL，因此高于此濃度的均記載為480+ng/mL。隨訪時間12～25個月，平均時間18.02個月。最終轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)定義：穿刺細(xì)胞病理或者術(shù)后組織病理證實為轉(zhuǎn)移性。非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)定義：1）穿刺細(xì)胞病理及術(shù)后組織病理均未檢出癌細(xì)胞；2）穿刺細(xì)胞病理未檢出癌細(xì)胞且術(shù)后隨訪12個月以上B超檢查無進(jìn)展。由于本組隨訪的淋巴結(jié)均未出現(xiàn)明顯體積變化，因此定義B超檢查無進(jìn)展為B超檢查未出現(xiàn)新的可疑淋巴結(jié)超聲征象。對于隨訪期間再次行FNA及FNA-Tg檢查的患者，要求細(xì)胞病理學(xué)結(jié)果無異常且FNA-Tg處于低水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以或四分位數(shù)間距（IQR 25%～75%）表示。t檢驗、χ2檢驗及Mann-WhitneyU檢驗比較轉(zhuǎn)移性及非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組間的差別。構(gòu)建受試者工作特征曲線（ROC曲線），計算曲線下面積（AUC），根據(jù)約登指數(shù)最高的臨界點及特異度優(yōu)先的原則確定FNA-Tg對本研究中淋巴結(jié)的最佳診斷閾值。Spearman相關(guān)性分析用來評估FNA-Tg與相關(guān)實驗室指標(biāo)間的關(guān)系。利用二分類Logistic回歸分析探討與FNA-Tg＞1.295 ng/mL及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移性及非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組間比較

術(shù)前超聲共檢出267枚可疑淋巴結(jié)，其中位于Ⅵ區(qū)9枚，側(cè)頸區(qū)258枚。手術(shù)病理證實的淋巴結(jié)共179枚，其中轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)140枚，非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)39枚。隨訪的88枚淋巴結(jié)復(fù)查B超均未見進(jìn)展。一般臨床資料中，兩組患者年齡比較有顯著性差異（t=2.936，P=0.004），轉(zhuǎn)移組年齡較小，性別構(gòu)成無顯著性差異。相關(guān)實驗室檢查中，兩組血Tg及FNA-Tg比較有顯著性差異（均P＜0.001），轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)均明顯高于非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)（表1）。

表1 131例患者轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)與非轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)的比較

2.2 FNA-Tg的定量分析及ROC曲線

繪制ROC曲線，AUC值為0.965（圖1）。進(jìn)一步計算約登指數(shù)，得出FNA-Tg的最佳診斷閾值為1.295 ng/mL，此時診斷的靈敏度與特異度之和最高。考慮到PTC的良好預(yù)后，優(yōu)先選擇特異度較高的最佳診斷閾值。

圖1 FNA-Tg診斷術(shù)前PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

2.3 FNA-Tg、FNA及聯(lián)合法診斷效能的比較

FNA結(jié)果顯示穿刺病理陰性淋巴結(jié)87枚，陽性淋巴結(jié)86枚，可疑淋巴結(jié)39枚，病理不滿意淋巴結(jié)55枚（表2）。穿刺病理陽性及可疑淋巴結(jié)歸為穿刺轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組，穿刺病理陰性及不滿意淋巴結(jié)歸為穿刺非轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組，計算FNA診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的靈敏度為87.1%，特異度為97.6%。FNA-Tg、FNA及聯(lián)合法三者的比較后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合法有最佳的診斷效能。

2.4 淋巴結(jié)解剖學(xué)分區(qū)及相關(guān)實驗室指標(biāo)對FNA-Tg診斷效能的影響

本研究共納入9枚Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)，剔除Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)后再次繪制ROC曲線，F(xiàn)NA-Tg的最佳診斷閾值不變，AUC為0.972，靈敏度為91.9%，特異度為95.9%。相比整體分析，AUC及特異度均有所提高。相關(guān)性研究顯示sTg與FNA-Tg呈正相關(guān)（P=0.326，P＜0.001），而TSH、sTgAb與FNA-Tg無明顯相關(guān)性（P=0.006，P=0.935；P=-0.005，P=0.940）。進(jìn)一步Logistic回歸分析提示sTg是FNA-Tg＞1.295 ng/mL的獨立預(yù)測因子 ，OR值為1.018（95%CI=1.000～1.035，P=0.044）。年齡、TSH、sTg、sTgAb及FNA-Tg對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響的Logistic回歸分析中顯示，年齡及FNA-Tg是獨立預(yù)測因子（P＜0.001，OR=0.934，95%CI=0.902～0.968；P＜0.001，OR=1.014，95%CI=1.007～1.021，表3）。

表2 轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)與非轉(zhuǎn)移組淋巴結(jié)的FNA-Tg及細(xì)胞病理結(jié)果比較

表3 FNA-Tg、FNA及聯(lián)合法診斷效能的比較 （%）

3 討論

甲狀腺癌術(shù)前頸部淋巴結(jié)的評估對于臨床分期、手術(shù)方式的選擇以及預(yù)后有深遠(yuǎn)的影響。目前，超聲及超聲引導(dǎo)下FNA已成為臨床上診斷甲狀腺癌轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)最常用的方法。據(jù)報道［8］FNA的靈敏度約71%～86%，特異度為80%～100%。而當(dāng)淋巴結(jié)過小或發(fā)生囊性病變時，其假陰性率進(jìn)一步增高。另外，一些非甲狀腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及炎癥性腫大淋巴結(jié)可能會影響細(xì)胞病理科醫(yī)師的診斷。1992年P(guān)acini等［9］首先報道了FNA-Tg的檢測技術(shù)，認(rèn)為甲狀腺癌全切術(shù)后淋巴結(jié)內(nèi)高濃度的FNA-Tg提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。隨后國內(nèi)外進(jìn)行了多項研究，比較了FNA、FNA-Tg及兩者聯(lián)合的診斷效能。越來越多的證據(jù)認(rèn)為FNA-Tg具有更高的靈敏度，而特異度并不差于FNA，且兩者聯(lián)合法有更高的診斷效能［3-6］。本研究結(jié)果顯示FNA-Tg診斷PTC轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的靈敏度和特異度分別為92.1%和94.5%，而FNA的分別為87.1%和97.6%，兩者聯(lián)合進(jìn)一步提高了診斷效能。

但是FNA-Tg方法學(xué)的不統(tǒng)一、不同的計算方法（如FNA-Tg/sTg比值＞1、非轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)FNA-Tg均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差等）、最佳診斷閾值的不確定以及其他可能存在的影響因素限制其臨床使用。2015年ATA指南中FNA-Tg僅推薦作為合適患者的輔助診斷方法，證據(jù)級別較低，在國內(nèi)該方法也遠(yuǎn)未普及［1］。因此，本研究探討了本中心PTC患者甲狀腺全切術(shù)前的最佳診斷閾值和可能的影響因素。既往不同研究曾得出數(shù)個不同的最佳診斷閾值，范圍從0.2～50 ng/mL［10-16］，跨度較大，這可能與測定FNA-Tg的方法學(xué)及“金標(biāo)準(zhǔn)”定義不同有關(guān)。另外，甲狀腺全切是否會影響最佳閾值也存在爭議。一般認(rèn)為甲狀腺全切術(shù)前的診斷閾值較術(shù)后高。Boi等［2］報道甲狀腺全切術(shù)前及術(shù)后的最佳診斷閾值分別為36 ng/mL及1.7 ng/mL。Pak等［12］系統(tǒng)評價中得出結(jié)果同樣相似（32.04 ng/mLvs.0.9 ng/mL）。Moon等［16］的一項大型研究中測定的甲狀腺全切術(shù)前及術(shù)后的最佳診斷閾值分別為2.24 ng/mL及1.09 ng/mL。但Jung等［14］認(rèn)為最佳閾值均在1 ng/mL，與手術(shù)方式關(guān)系不大。國內(nèi)相關(guān)資料不多，本院既往研究測定術(shù)前PTC側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最佳診斷閾值為26.5 ng/mL［13］。而本研究納入同樣甲狀腺全切術(shù)前患者，F(xiàn)NA-Tg最佳診斷閾值為1.295 ng/mL。這一結(jié)果與之前的研究差別較大，可能與本研究樣本量較大以及部分患者以術(shù)后隨訪結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”有關(guān)。

考慮到甲狀腺乳頭狀癌的良好預(yù)后，臨床上FNA-Tg的假陽性更應(yīng)引起重視。本研究數(shù)據(jù)中高于最佳診斷閾值的假陽性淋巴結(jié)共7枚。最高值分別為202.68 ng/mL及480+ng/mL，相應(yīng)的2枚淋巴結(jié)均位于Ⅵ區(qū)。有研究［12，17］認(rèn)為Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)的穿刺易受到甲狀腺床區(qū)組織的影響，產(chǎn)生假陽性，不推薦使用FNA-Tg。因此，本研究剔除Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)后再分析ROC曲線，發(fā)現(xiàn)AUC由0.965提高至0.972，特異度由94.5%升至95.9%，但最佳診斷閾值未變。這可能與本研究僅納入9枚Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)，樣本量與側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)相差較大，因此未能影響最佳診斷閾值。

關(guān)于一些相關(guān)實驗室指標(biāo)（如TSH、sTg及sTgAb）對FNA-Tg的影響，目前均無定論。因此，本研究探索其對FNA-Tg的影響。由于甲狀腺全切術(shù)前患者sTg及sTgAb指標(biāo)較高，且波動范圍較大，因此，關(guān)于sTg及sTgAb對FNA-Tg是否有影響一直以來頗具爭議。有研究［17］認(rèn)為淋巴結(jié)穿刺過程中容易受血液污染或者擠壓甲狀腺組織造成Tg逃逸，因此sTg會影響FNA-Tg的水平。但是，也有研究認(rèn)為sTg的影響并不明顯，僅在sTg較高時才有可能發(fā)生［18］。本研究sTg與FNA-Tg存在正向相關(guān)性，Logistic分析同樣提示sTg是FNA-Tg＞1.295 ng/mL的獨立預(yù)測因子，OR值為1.018。因此本研究認(rèn)為sTg確實會影響FNA-Tg，但由于兩者的相關(guān)性并不強(qiáng)烈，因此影響力不大。本研究高于最佳診斷閾值的假陽性淋巴結(jié)中5枚位于側(cè)頸區(qū)，其sTg水平為7.5～313.4 ng/mL，平均值為89.1 ng/mL。所以當(dāng)sTg濃度較高時，F(xiàn)NA-Tg的結(jié)果解讀需要謹(jǐn)慎。眾所周知，sTgAb對于sTg有相當(dāng)大的影響，因此在甲狀腺癌全切術(shù)后的隨訪中sTgAb也是重要的參考指標(biāo)之一。可sTgAb對于FNA-Tg是否存在影響存在爭議。Baskin等［19］首先提出由于淋巴結(jié)中的Tg位于細(xì)胞內(nèi)，不會產(chǎn)生TgAb的免疫反應(yīng)。另外，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)高濃度的Tg可能也會抵消sTgAb的影響。Boi等［2］和Frasoldati等［3］也認(rèn)為sTgAb對于FNA-Tg影響不大。盡管Jeon等［20］在初始的研究中提出sTgAb可能會造成FNA-Tg的假陰性，但其隨后的研究及越來越多的研究也認(rèn)為sTgAb對FNA-Tg無明顯影響［21-23］。本研究sTgAb和FNA-Tg為負(fù)向相關(guān)，但無顯著性差異，證明sTgAb對FNA-TgAb影響不大。此外，由于本研究對象均為甲狀腺全切術(shù)前患者，TSH波動范圍較小，因此TSH與FNA-Tg未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。但其他納入較多全切術(shù)后患者的研究中有得出相關(guān)性［24］。因此，本研究結(jié)論不能盲目推廣至術(shù)后患者，應(yīng)專門收集術(shù)后患者的數(shù)據(jù)再進(jìn)行研究。綜合而言，F(xiàn)NA-Tg在診斷術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的獨立性較好。在判斷過程中，當(dāng)FNA細(xì)胞病理不能明確時，F(xiàn)NA-Tg可以作為有力的補(bǔ)充方法。但若sTg較高，要注意結(jié)合其他臨床資料綜合判斷。

本研究尚存在一定的局限性：1）本研究均為術(shù)前患者，對于甲狀腺癌全切術(shù)后患者還需要進(jìn)一步的探索；2）未完全取得所有的淋巴結(jié)組織病理資料，部分患者根據(jù)隨訪資料判斷淋巴結(jié)的性質(zhì)，這可能存在假陰性；3）目標(biāo)淋巴結(jié)的精準(zhǔn)定位一直是困擾此類研究者的最大難題。本研究B超報告中已使用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)分區(qū)匯報，并詳細(xì)描述可疑淋巴結(jié)與相鄰解剖標(biāo)志之間的位置關(guān)系。此外，手術(shù)過程做到術(shù)前麻醉后美藍(lán)定位，術(shù)后分區(qū)送檢病理。但這些仍不能保證目標(biāo)淋巴結(jié)的絕對一致。因此，期待在將來的研究中對術(shù)后淋巴結(jié)標(biāo)本行穿刺洗脫液檢查來解決此難題。

綜上所述，本研究顯示FNA-Tg是術(shù)前診斷PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要方法，尤其在側(cè)頸淋巴結(jié)中診斷效能較好。本研究中最佳診斷閾值是1.295 ng/mL，但當(dāng)sTg較高，F(xiàn)NA-Tg的結(jié)果解讀需要謹(jǐn)慎。FNATg在甲狀腺全切術(shù)后判斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用和相關(guān)問題值得進(jìn)一步探索。