2709堿性蛋白酶水解豬腸黏膜制備肝素工藝條件優(yōu)化研究

張秋會，徐俊濤，李苗云，趙改名，高曉平

（1.河南農業(yè)大學食品科學技術學院，河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南鄭州 450002；2.漯河雙匯肉業(yè)有限公司，河南漯河 462000）

中國是肉制品生產大國，每年豬牛屠宰量達10億頭以上，畜禽副產物資源極為豐富[1-2]，僅豬小腸年產量達50×104t。但是，目前畜禽內臟等副產物的深加工利用率還很低。如何提高畜禽副產物的加工利用率成為了眾多企業(yè)面臨的嚴峻問題。而副產物的加工利用途徑主要是2個方面，一是作為原料加工成為消費者可食用性產品；二是生產具有經(jīng)濟效益的非食用性產品，如藥品、塑料、能源物質[3-4]。

肝素是一種抗凝血、抗血栓形成的藥物[5-6]。早在1916年，研究凝血機制時在狗的肝臟中被Mclean發(fā)現(xiàn)，是一種酸性黏多糖物質[7]，后來被人們證實其抗凝血作用，并廣泛應用于臨床，得到世界各國的重視[8-10]。在肝素提取制備工藝技術中，酶法[11-12]、超聲波提取法[13]、鹽析提取法[14]等方法得到了廣泛應用，其中酶法具有反應條件吻合、得率高等優(yōu)點。

因此，試驗利用2709堿性蛋白酶，以豬腸黏膜為載體，開展畜產品副產物附加產品的關鍵技術研究，以黏膜酶解液效價為評價指標，對影響2709堿性蛋白酶水解過程中的各種因素進行優(yōu)化研究，確定合適的水解工藝條件，為酶法工業(yè)化生產肝素提供依據(jù)，提高畜產品加工副產物的附加值，促進肉類加工企業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬小腸黏膜，雙匯泰威遜食品公司提供；2709堿性蛋白酶（酶活力為20×104U/g），龐博生物工程有限公司提供；肝素鈉標準品，USP Rockville，MD.LOT L11033）；綿羊血漿，山東蒼山向明生化助劑廠提供；氫氧化鈉、乙醇、氯化鈉、氯化鈣等均為分析純，市售；UV power紫外可見分光光度計等。

建立信息發(fā)布平臺，采用大數(shù)據(jù)、互聯(lián)網(wǎng)等技術，將近3-5年內可轉移轉化的科研成果、專利等信息經(jīng)過整合后匯集至信息平臺。將信息平臺推廣至企業(yè)，企業(yè)可以查看最新的科研成果，也可發(fā)布近期需求。利用大數(shù)據(jù)等技術將雙方信息進行匹配，匹配度高的需要重點關注、重點規(guī)劃，進行轉化。定期開展調研交流、成果展示活動，或聘請一些企業(yè)家顧問，打破壁壘，充分了解市場的需求，使高校和企業(yè)的信息充分交流互通。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶活力的測定

敘事語體是以人為本的，以主要人物的活動為線索，展開事件活動，注重時間線性；而描寫語體則是以物為本，描述場景中的各種事物狀態(tài)，注重空間性狀的凸顯性。在敘事語體當中，動詞的功能必須強化，而在描寫語體中，動詞的功能則表現(xiàn)出弱化的傾向。

1.2.2 小腸黏膜酶解

酶底物質量分數(shù)對酶解效價的影響見圖3。

1.2.3 肝素效價的測定

料液比對酶解效價的影響見圖6。

1.3 單因素試驗

我剛投身鄉(xiāng)村做了一名小學老師，對教育抱有很大的熱情，對學生也關愛有加，沒多久，我就和可愛的小天使們打成了一片。那年的梔子花開得格外燦爛，能在鄉(xiāng)村看到那潔白醇香的梔子花，我甚是歡喜。走在校園里，孩子們佩戴著梔子花，許多人手中拿著一朵潔白的花，香氣充溢著整個校園。其他老師的辦公桌上都是大朵大朵的梔子花，它們是那么白，那么香，我滿心期待走進自己的辦公室，卻發(fā)現(xiàn)桌上一朵也沒有。

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單因素試驗因素與水平設計見表1。

在國家和內地的支持下，至2016年，90%以上的學校包括邊遠貧困地區(qū)學校接入寬帶，西部、民族及貧困地區(qū)教育信息化步伐明顯加快，很多西部偏遠山村教學點用上了電腦，走進數(shù)字化時代，越來越多的鄉(xiāng)村學校悄然改變。

1.4 酶解條件優(yōu)化

依據(jù)單因素試驗結果，主要考慮水解溫度、水解時間、酶底物質量分數(shù)等因素，利用Box-Benken設計，進行三因素三水平優(yōu)化試驗。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0中的ONE-WAY ANOVA及REGRESSION等程序進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 水解時間對酶解液肝素效價的影響

水解時間對酶解液效價的影響見圖1。

圖1 水解時間對酶解液效價的影響

由圖1可以看出，在1.5～3.0 h時，隨著水解時間的延長，酶解液效價逐漸增大；水解3.0 h時達到最大，為6.14，而且顯著高于其他各水平，與3.5 h時無顯著差異性；在4.0～4.5 h，酶解液效價顯著降低。水解時間是影響酶促反應的關鍵因素，時間短酶促反應未完全進行，時間太長又可能引起肝素的化學結構變化。因此，在規(guī)定條件下，3 h是最佳水解時間。

2.2 水解溫度對酶解液肝素效價的影響

水解溫度對酶解效價的影響見圖2。

圖2 水解溫度對酶解效價的影響

由圖2可以看出，隨著水解溫度的升高，酶解液效價顯著增大；54～56℃時酶解液效價達到7.45，顯著高于其他各水平；56℃以后，酶解液效價顯著下降。酶促反應溫度決定酶促化學反應速度，偏離酶最適反應溫度的溫度均對酶促反應不利。溫度過低，酶活力低，反應不完全；溫度過高，肝素中N-硫酸基水解失活，降低酶解液效價。因此，2709堿性蛋白酶水解豬腸黏膜最佳水解溫度為54～56℃，為便于開展研究，后期選擇2709堿性蛋白酶水解豬腸黏膜最佳酶解溫度為55℃。

2.3 酶底物質量分數(shù)對酶解液肝素效價的影響

首先稱取70 g的小腸黏膜樣品置于燒杯中，按照試驗要求添加2709堿性蛋白酶、水，調整pH值，置于恒溫水浴鍋中，記錄時間，勻速攪拌，進行水解。水解結束后，在85℃，10 min條件下水浴處理，進行滅酶處理。然后收集酶解液，進行酶液肝素效價測定。若不能及時進行測定，密封保存于4℃條件下備用。

圖3 酶底物質量分數(shù)對酶解效價的影響

由圖3可以看出，隨著酶底物質量分數(shù)的升高，酶解液效價顯著增大；0.80%時酶解液效價達到9.28，顯著高于其他水平；0.80%以后，酶解液效價顯著下降。2709堿性蛋白酶水解小腸黏膜提取肝素，蛋白酶過量可將肝素水解，使其失活，效價降低。因此，2709堿性蛋白酶水解豬腸黏膜最佳酶底物質量分數(shù)為0.80%。

2.4 食鹽濃度對酶解液肝素效價的影響

食鹽濃度對酶解效價的影響見圖4。

圖4 食鹽濃度對酶解效價的影響

由圖4可以看出，食鹽濃度為0.15～0.30 mol/L時，隨著食鹽濃度的升高，酶解液效價顯著增大；當食鹽濃度達0.30 mol/L時，酶解液效價達到10.70，顯著高于其他各水平；0.30 mol/L以后，酶解液效價顯著下降。食鹽濃度的大小與肝素活性及溶解度有關，過高或過低的食鹽濃度均不利于肝素鈉的提取。因此，2709堿性蛋白酶水解豬腸黏膜最佳食鹽濃度為0.30 mol/L。

2.5 pH值對酶解液肝素效價的影響

pH值對酶解效價的影響見圖5。

根據(jù)響應面統(tǒng)計方法對試驗結果進行擬合，得出酶底物質量分數(shù)、水解時間，水解溫度的擬合方程：

圖5 pH值對酶解效價的影響

2.6 料液比對酶解液肝素效價的影響

肝素效價的測定參考文獻[15]的方法，用冷凍羊血漿法測定。

由2.1節(jié)得到人口數(shù)量的非參數(shù)貝葉斯估計結果,預測2006—2010年中國人口數(shù)量如表3所示.表4為預測均方誤差.表4表明在對中國人口數(shù)量進行預測時,非參數(shù)貝葉斯估計與局部線性回歸相比較,均方誤差較小,在一定程度上克服了局部線性回歸方法在預測外推方面效果較差的問題.

主要考慮影響水解的常規(guī)因素，包括水解溫度、水解時間、pH值、酶底物質量分數(shù)（酶質量與小腸黏膜質量的百分比）等進行單因素試驗。考查指標為酶解液肝素效價。

晚期史詩所表現(xiàn)的人物與情節(jié)都具有很強的現(xiàn)實性。例如，著名的法蘭西史詩《羅蘭之歌》，產生于十一世紀初葉，是以現(xiàn)實中的帝王將相武功為內容的敘事體詩歌，在歐洲被稱為“紀功歌”，敘述的是九世紀流傳的查理大帝和他的勇將羅蘭的事跡。眾所周知，查理一世(公元742—814年)，或稱查理大帝、查理曼，是法蘭克國王矮子丕平的兒子，公元769年繼承王位，后通過征略成為倫巴德人、托斯卡納人、薩克森人的國王，公元800年受羅馬教皇利奧三世加冕做了皇帝，統(tǒng)治了歐洲大部地區(qū)，建立起羅馬帝國之后的又一大帝國。史詩中所描寫的諸多戰(zhàn)役，大都見諸史料記載。例如，詩的開篇寫道：

圖6 料液比對酶解效價的影響

由圖6可以看出，隨著料液比的降低，酶解液效價顯著增大；料液比1∶7時，酶解液效價達到45.25，顯著高于其他水平；料液比1∶7（g∶L） 以后，酶解液效價呈下降趨勢。料液比小，攪拌不均勻，酶與底物反應不完全；料液比大，雜蛋白可能溶解，使酶解液效價降低，不利于純化，生產成本增加。

（1）藥品的使用控制。如何規(guī)范醫(yī)生的開單行為，限制藥品的濫用是醫(yī)院永恒的管理問題。醫(yī)院需要將每個藥品的處方權限制到科室和個人，通過藥品專家委員會討論確定診斷和臨床科室對應的藥品目錄，超診斷或科室藥品使用目錄開單的，信息系統(tǒng)自動提示需要經(jīng)過相關部門的審批；發(fā)現(xiàn)醫(yī)生存在違規(guī)用藥行為的，暫停責任醫(yī)生違規(guī)藥品的處方權，以此實現(xiàn)對醫(yī)生開單行為的控制。

2.7 響應面優(yōu)化及結果

依據(jù)2709堿性蛋白酶酶解豬腸黏膜單因素試驗結果，利用Box-Benken設計，選擇進行三因素（水解溫度、水解時間、酶底物質量分數(shù)）3個水平響應面優(yōu)化試驗。

試驗因素與水平設計見表2，響應面試驗結果見表3。

2709堿性蛋白酶活力測定方法參考文獻[14]的方法進行，測得堿性蛋白酶活力為9.55 U/mg。

表2 試驗因素與水平設計

由圖5可以看出，pH值8.2～8.8時，隨著pH值的升高，酶解液效價顯著增大；酶解溶液pH值8.8時酶解液效價達到7.65，顯著高于其他pH值水平；酶解溶液pH值8.8以上，酶解液效價顯著下降。因此，選擇最佳的料液pH值為8.8。

回歸模型方差分析結果見表4。

為更好地保護中國投資者的海外投資利益，且鑒于公司國籍國實施外交保護的權威性，中國宜采取的方案是：將“一國對由于損害的原因按照公司國籍國法律終止存在的公司在合理期限內未能提供外交保護”的情形，納入股東國籍國實施外交保護的范圍。

表3 響應面試驗結果

表4 回歸模型方差分析結果

由表4可以看出，回歸模型具有高度的顯著性（p＜0.000 1），失擬項在α=0.05水平上不顯著（p=0.072 2＞0.05），說明回歸方程與實際情況吻合的較好，誤差小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。

由表4及擬合方程可知，該模型極顯著，能很好地解釋數(shù)據(jù)差異性。其中酶底物質量分數(shù)、水解時間，對肝素提取的影響表現(xiàn)為極顯著。另外，該模型的確定系數(shù)為0.995 8，調整確定系數(shù)為0.990 3，說明該回歸模型對數(shù)據(jù)的擬合程度較好，適于對肝素提取進行分析及預測。該模型的失擬項為0.004 9，表現(xiàn)為不顯著，因此該模型穩(wěn)定性較好，能很好預測各因素對響應值的影響。

2.8 響應面分析

響應面圖形是響應值對應于試驗因素所構成的可以反映各因素及因素間的交互作用對響應值的影響。將一個因素固定在零水平，可以作出兩因素交互作用的響應曲面圖和等高線圖。等高線越圓，說明它們之間相互作用對肝素提取的影響越小；而等高線越接近橢圓，表示因素之間的相互影響越大。

酶底物質量分數(shù)和水解溫度對酶解液效價的影響見圖7，酶底物質量分數(shù)和水解時間對酶解液效價的影響見圖8，水解溫度和水解時間對酶解液效價的影響見圖9。

圖7 酶底物質量分數(shù)和水解溫度對酶解液效價的影響

圖8 酶底物質量分數(shù)和水解時間對酶解液效價的影響

圖9 水解溫度和水解時間對酶解液效價的影響

從圖7～圖9可以看出，酶底物質量分數(shù)和水解時間交互作用對酶解液肝素效價影響最小。

對于保肢失敗的患者，不僅身體上痛苦，心理上也有巨大傷害，經(jīng)濟上需承受巨大壓力[1]。導致患者截肢的危險因素眾多，本研究所指的保肢失敗主要有以下2種情況：一種是保肢手術后肢體未能成活，另一種是肢體雖成活但由于引起嚴重并發(fā)癥、中途放棄保肢或后期肢體功能差、畸形嚴重而延期截肢[2]。

2.9 最佳酶解條件確定及驗證試驗

利用回歸方程，在優(yōu)化條件下，對酶底物質量分數(shù)、水解溫度、水解時間對應的酶解液效價進行預測和實際測定。

響應優(yōu)化值與真實值之間的關系見表5。

表5 響應優(yōu)化值與真實值之間的關系

由表5可以看出，預測值與真實值之間具有98.1%的相關性，可以利用上述回歸方程對2709堿性蛋白酶水解腸黏膜過程進行預測和控制。

在應用道路簡化模型求解最優(yōu)路徑時，由于初始位置與終止位置并不一定是在某個充電站，而可能在任何地方。因此，在建立道路簡化模型時，要將初始位置與終止位置作為虛擬充電站同樣納入模型之中，這樣便能實現(xiàn)任意位置的路徑規(guī)劃。

同時，選擇編號為“1”的參數(shù)進行50 kg豬腸黏膜水解的中試試驗，中試結果與預測結果基本一致。因此，根據(jù)實際生產條件，2709堿性蛋白酶水解豬腸黏膜最適條件為水解溫度55℃，水解時間3 h，pH值8.8，酶底物質量分數(shù)0.70%，鹽濃度0.30 mol/L，料液比1∶7。

3 結論

通過單因素試驗獲得了2709堿性蛋白酶（酶活力為9.55 U/mg）水解豬小腸黏膜最佳條件為水解溫度55℃，水解時間3 h，pH值8.8，酶底物質量分數(shù)0.70%，食鹽濃度0.30 mol/L，料液比1∶7。響應曲面優(yōu)化2709堿性蛋白酶酶解條件為酶底物質量分數(shù)0.70%，水解溫度55℃，水解時間3 h；驗證試驗證明該水解條件可行。