我國(guó)豬德?tīng)査跔畈《静〉牧餍星闆r及分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

于新友，李天芝

(山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

豬德?tīng)査跔畈《?Porcine Deltacoronavirus， PDCoV) 又稱為豬δ 冠狀病毒或丁型冠狀病毒，它是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種病毒[1]，可引起豬的腹瀉。PDCoV 為冠狀病毒科、δ 冠狀病毒屬[2]，病毒粒子呈球形，直徑大小約120 ～180 nm，具有囊膜和纖突。2009 年中國(guó)香港科研工作者首次報(bào)道了PDCoV 的存在，但并沒(méi)有涉及其致病性。直到2014年美國(guó)一豬場(chǎng)發(fā)生了由該病毒引起的仔豬腹瀉，才證實(shí)了該病毒的致病性，病毒分離后的仔豬攻毒試驗(yàn)，又進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證，隨后，加拿大、中國(guó)、韓國(guó)、越南、老撾等國(guó)均有相關(guān)報(bào)道。近年來(lái)，該病發(fā)病率有上升的趨勢(shì)。

PDCoV 病主要通過(guò)消化道傳播，發(fā)病急，傳播迅速。各品種和日齡的豬均可感染，主要臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉、嘔吐、和脫水等；病變主要在小腸，尤其是空腸和回腸，表現(xiàn)為腸壁變薄，腸內(nèi)充滿氣體和黃色液體，腸黏膜脫落，臨床上很難與PEDV 等其他病毒性疾病鑒別。哺乳仔豬感染后受到的危害嚴(yán)重，死亡率高，生長(zhǎng)豬和成年豬感染后死亡率低[3]。易與PEDV、TGEV、RV 等混感，致豬死亡率增加，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

PDCoV 為不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約 25.4 kb[4]，括5′端非編碼區(qū)，3′端非編碼區(qū)，編碼 4 個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，分別為表面纖突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼(N)蛋白。其中 N 蛋白含量高，免疫原性強(qiáng)，保守性好，在病毒感染豬后針對(duì)該蛋白的抗體最早產(chǎn)生、且持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，是適合血清學(xué)診斷方法的首選靶蛋白。M 基因高度保守，是分子檢測(cè)的首選靶基因，S 基因則是病毒做變異分析的首選靶基因。PDCoV 可用豬睪丸細(xì)胞和豬腎上皮細(xì)胞進(jìn)行該病毒的分離培養(yǎng)，細(xì)胞病變表現(xiàn)為變圓、聚集，最后脫落，但通常病毒分離培養(yǎng)較困難，需添加胰酶、胰腺酶等，否則即使能分離病毒滴度也比較低。文章就近年來(lái)PDCoV 在我國(guó)的流行情況及分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為PDCoV 病的快速診斷和防控提供參考。

1 我國(guó)豬德?tīng)査跔畈《静〉牧餍星闆r

病豬和帶毒豬是主要傳染源。病毒通過(guò)糞便、乳汁、唾液等分泌物排出體外，污染飼料、飲水及周圍環(huán)境，通過(guò)消化道傳染其他健康豬只。PDCoV 可感染亞洲豹貓和中國(guó)白鼬獾群等，但豬是目前感染后唯一有發(fā)病報(bào)道的動(dòng)物。成年豬常呈一過(guò)性腹瀉，哺乳仔豬死亡率高。PDCoV 一年四季均可發(fā)生，冬春季節(jié)多發(fā)。PDCoV 在我國(guó)各地豬場(chǎng)廣泛存在，不同省份和地區(qū)均有相關(guān)報(bào)道，2012—2015 年采集自江西省各地區(qū)的249 份腹瀉母豬糞便及腹瀉仔豬糞便/腸道樣本進(jìn)行病原檢測(cè)，結(jié)果顯示，腹瀉樣本中PDCoV 的檢出率為31.33%(78/249)，其中母豬糞便中PDCoV 的檢出率(27.78%)，仔豬糞便及腸道樣品PDCoV 的檢出率(31.92%)。2014—2015 年河南、湖南、浙江、江西、安徽、河北、黑龍江、江蘇、山東和上海等10 個(gè)省市共254 份腹瀉仔豬小腸勻漿或糞便樣本，共檢出11 份PDCoV 陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性率為4.33%。2014—2015 年我國(guó)華東地區(qū)豬場(chǎng)送檢的526 份臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，PDCoV 總陽(yáng)性率為4.75%（25/526），腹瀉樣品陽(yáng)性率為25.76%(17/66)。2016—2017 年 對(duì) 河北省130 份仔豬腹瀉樣本檢測(cè)，結(jié)果顯示，PDCoV 的檢出率為16.9%，PEDV 的檢出率為66.2%，二者同時(shí)感染的檢出率為2.3%。2012—2016年廣東省420 份豬腹瀉病料樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，PDCoV 的陽(yáng)性率為13.33%，PDCoV 與豬流行性腹瀉病毒混合感染率為5.95%[5]。2015—2017 年四川省各地區(qū)226 份豬腹瀉樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，PDCoV 陽(yáng)性樣品16 份，陽(yáng)性率為7.1%。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

2.1 常規(guī)RT-PCR 法

RT-PCR 是以病毒的RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR 進(jìn)行核酸擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)病毒的方法，較病毒分離鑒定等傳統(tǒng)的方法，檢測(cè)速度快，靈敏度高，在動(dòng)物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。張帆帆等[6]根據(jù)PDCoV N 基因設(shè)計(jì)引物，建立了PDCoV RT-PCR 檢測(cè)方法，該法特異性好，對(duì)PDCoV 僅擴(kuò)增出了329 bp 的單一條帶，而對(duì)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬庫(kù)布病毒（PKoV）、豬星狀病毒（PAstV），豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）及豬瘟病毒（CSFV）的核酸無(wú)交叉擴(kuò)增現(xiàn)象，檢測(cè)靈敏度，最低檢測(cè)限為1.0×103拷貝/μL。逄鳳嬌等[7]根據(jù)Gen Bank 中登陸的PDCoV M 基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成1 對(duì)特異性引物，建立了一種基于M 基因的PDCoV RT-PCR 檢測(cè)方法。該方法特異性較好，僅對(duì)PDCo V 有特異性的擴(kuò)增，對(duì)其他主要豬病病毒核酸擴(kuò)增均呈陰性，敏感性較高，最低檢測(cè)限可達(dá)6.33×104拷貝/μL。鄭麗等[8]建立了檢測(cè)PDCoV 的RT-PCR 方法，并對(duì)其敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，僅PDCoV 陽(yáng)性模板可擴(kuò)增得到359 bp 的目的條帶，而PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、輪狀病毒（RV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、偽狂犬病毒（PRV）、豬鏈球菌2 型、大腸桿菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能檢測(cè)到的最低核酸質(zhì)量濃度為1 ng/L。劉浩宇等[9]建立的RT-PCR 檢測(cè)PDCoV 的方法能夠擴(kuò)增出654 bp 的目的基因片段，其最佳退火溫度為60 ℃，上下游引物量為1.75 μL，且與PEDV、TGEV、日本乙型腦炎病毒(JEV)、RV、PRRSV、CSFV 等無(wú)交叉反應(yīng)，該方法最低可檢出8.82×109IU/mL 的PDCo V 核酸。

2.2 多重RT-PCR 法

多重PCR 是一種特殊的PCR技術(shù)，它在同一PCR 體系中，加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)2 種或2 種以上的病毒DNA，它具有快速、靈敏度高、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而廣泛用于臨床的快速診斷。任玉鵬等[10]根據(jù)GenBank 中PEDV 和TGEV 基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，參照文獻(xiàn)合成1 對(duì)PDCoV 引物，優(yōu)化3 對(duì)引物在同一RT-PCR擴(kuò)增體系下的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，同時(shí)優(yōu)化方法的靈敏度、特異性。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的多重RT-PCR 在引物量分別為PEDV 0.2 μL，PDCoV 0.2 μL 和TGEV 0.4 μL，退火溫度為53℃時(shí)的擴(kuò)增效果最佳，最低檢測(cè)量分別 為PEDV：60.96 pg、PDCoV：58.85 pg、TGEV：102.69 pg。用該法對(duì)多種豬傳染病病原DNA或cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)均無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。劉玲玲等[11]根據(jù)Gen Bank 中收錄的PDCoV N 基因和TGEV N 基因序列設(shè)計(jì)了2 對(duì)引物，通過(guò)對(duì)RT-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)PDCoV 和TGEV 的雙重RT-PCR 方法，結(jié)果顯 示，該 法 對(duì)PDCoV 和TGEV 的最低檢測(cè)量分別是3.14×102copies/μL 和3.68×103copies/μL，該法特異性好，對(duì)PEDV、PBoV、PRRSV、PRV 檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。韓麗等[12]根據(jù)GenBank 中登錄的PDCoV N 基 因 和PEDV M 基 因 序列，設(shè)計(jì)了2 對(duì)引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)PDCoV 和PEDV 的 雙 重RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該雙重RTPCR 對(duì)PD-CoV 和PEDV 的 最 低檢測(cè)量分別是3.14×103copies/μL和3.88×104copies/μL。該 方 法 僅對(duì)PDCoV 和PEDV 檢 測(cè) 為 陽(yáng) 性，對(duì)TGEV、豬博卡病毒(PBoV)、PRRSV 和PRV 等豬常見(jiàn)的感染病毒的擴(kuò)增均為陰性，說(shuō)明該方法具有較好的特異性。韋學(xué)雷等[13]建立 了PDCoV、PEDV 和TGEV 三重RT-PCR 檢測(cè)方法，該法對(duì)三種病毒檢測(cè)的敏感性分別為3.14×103拷 貝/μL、3.88×104拷 貝/μL 和3.68×104拷 貝/μL。所 建 立 的 方法具有較好的特異性，對(duì)PBoV、PRV、PRRSV、CSFV 和PCV2 等豬常見(jiàn)病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

2.3 熒光RT-PCR 方法

熒光RT-PCR是在常規(guī)RT-PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)速度快、敏感高，可直接觀察擴(kuò)增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，較少了對(duì)環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽(yáng)性結(jié)果。據(jù)信號(hào)基團(tuán)的不同，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以分為染料法和探針?lè)?種。秦毅斌等[14]根據(jù)PDCoV N基因序列在保守區(qū)設(shè)計(jì)合成特異性引物和TaqMan探針，建立了檢測(cè)PDCoV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法僅對(duì)PDCoV出現(xiàn)特異性擴(kuò)增反應(yīng)，與PEDV、TGEV、RV、PKoV、PRRSV、PRV、CSFV及PPV均無(wú)交叉反應(yīng)。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與2.2×109～ 2.2×101copies/μL之間的質(zhì)粒濃度具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Ct=-3.539×lgX+38.95，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為1.0，檢測(cè)下限為2.2 copies/μL。陳小金等[15]根據(jù)Gen Bank登錄的PDCoV毒株序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了檢測(cè)PDCoV的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。該方法在標(biāo)準(zhǔn)品濃度2.49×108～2.49×102copies/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，特異性試驗(yàn)顯示，其他幾種常見(jiàn)豬病病毒未見(jiàn)典型擴(kuò)增曲線，敏感性試驗(yàn)顯示，最低檢測(cè)下限為24.9 copies/μL，重復(fù)性試驗(yàn)顯示，批內(nèi)和批間變異系數(shù)小于3%。羅尚星等[16]根據(jù)PDCoV N基因和PEDV M基因的保守序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，建立了一種檢測(cè)PDCoV和PEDV的雙重的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明，試驗(yàn)所建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法對(duì)PDCoV和PEDV的最低檢測(cè)量分別為51/μL和32拷貝/μL，且與PBoV、TGEV、PRV、PCV2無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好。張利衛(wèi)等[17]建立了能同時(shí)檢測(cè)PDCoV和PEDV的SYBR Green Ⅰ雙重?zé)晒釸TPCR方法，結(jié)果顯示，該法最低能檢測(cè)到PDCoV和PEDV分別是28.6拷貝/μL和99.6拷貝/μL的質(zhì)粒濃度，顯示出較好的敏感性，在同樣擴(kuò)增條件下該方法具有較好的重復(fù)性，特異性試驗(yàn)表明，該方法僅能檢測(cè)出PEDV和PDCoV，而對(duì)TGEV、PRRSV、PCV2和PRV等均不產(chǎn)生特異性擴(kuò)增曲線。單穎等[18]建立了PDCoV一步法TaqMan探針熒光定量檢測(cè)方法，該法特異性好，對(duì)其他病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)3.94×102拷貝/μL，擴(kuò)增效率為108%，R2值為0.997，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.156X+1.826。肖帥等[19]根據(jù)Gen Bank中已公布的PDCoV N基因序列設(shè)計(jì)并合成特異的引物和TaqMan探針，構(gòu)建立了檢測(cè)PDCoV的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，以PEDV、TGEV、PKoV、PRRSV、和口蹄疫病毒（FMDV）為模板時(shí)均未檢測(cè)到熒光信號(hào)，表明該方法具有良好的特異性，用2.66×106、2.66×105和2.66×104copies/L這3個(gè)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)重復(fù)試驗(yàn)，循環(huán)閾值Ct的變異系數(shù)均低于2%，表明該方法具有良好的特異性，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.461，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998，表明閾值和模板濃度之間具有良好的線性關(guān)系。10倍梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)的最低限度為2.66×101copies/L的質(zhì)粒DNA，表明此方法具有良好的敏感性。張利衛(wèi)等[20]根據(jù)Gen Bank中公布的PDCoV M基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以SYBR Premix ExTaq為熒光染料，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了針對(duì)PDCoV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，所建立的方法具有高度敏感性，最低檢測(cè)限為54拷貝/μL，應(yīng)用該方法對(duì)TGEV、PEDV和PRRSV等其他常見(jiàn)豬病毒性病原檢測(cè)均為陰性，表明所建立的方法具有較好的特異性，且具有較好的重復(fù)性，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1%。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi 等發(fā)明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，一臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，結(jié)果可通過(guò)肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來(lái)判斷，簡(jiǎn)便快捷，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門應(yīng)用。王乃福等[21]針對(duì)PDCoV N 基因設(shè)計(jì)特異性引物，并從反應(yīng)時(shí)間、溫度、各組分濃度等方面優(yōu)化了反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了PDCoV 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RT-LAMP)快速檢測(cè)方法。該方法能夠在65 ℃條件下1.5 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)PDCoV N 基因片段的特異性擴(kuò)增，與其他病毒，如TGEV、PEDV、RV、FMDV、水泡性口炎病毒（VSV）等的核酸無(wú)交叉反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，可在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2μL50 倍 稀 釋 的SYBR Green I 染料，在紫外燈和日光下觀察反應(yīng)管顏色變化，將擴(kuò)增管在可見(jiàn)光下觀察如呈黃綠色，則判為陽(yáng)性，如為橘紅色，則判為陰性。對(duì)質(zhì)粒DNA的最小檢測(cè)量為10 拷貝/μL。何穎等[22]建立了PDCoV RT-LAMP 檢測(cè)方法，該方法能夠在63 ℃條件下1 h 內(nèi)檢測(cè)反應(yīng)，與其他病毒，如PEDV、TGEV、PKoV、PBoV、PPV、PCV2 和PRV 等的核酸無(wú)交叉反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在可見(jiàn)光下，通過(guò)肉眼直接觀察反應(yīng)結(jié)果，如果反應(yīng)管呈明顯渾濁，短暫離心后，管底部有白色沉淀物，則為檢測(cè)陽(yáng)性，如果反應(yīng)管透明，則判為陰性。該方法對(duì)病毒RNA 檢測(cè)的敏感度為2.47×10-10ng/μL。

3 小結(jié)

疾病的正確診斷是進(jìn)行有效防控的前提和基礎(chǔ)，隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，臨床上的豬病變得越來(lái)越復(fù)雜，老病新發(fā)和疾病混感現(xiàn)象增加，很難通過(guò)臨床表現(xiàn)和眼觀病變?cè)\斷疾病，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行精準(zhǔn)診斷，從而及時(shí)采取有效的措施，降低損失。PDCoV 病是豬的一種新發(fā)的一種病毒性腹瀉傳染病，在臨床表現(xiàn)上與PED、TGE 和豬輪狀病毒病等類似，很難鑒別診斷，只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)室方法鑒別。血清學(xué)檢測(cè)檢測(cè)方法不能判定是否現(xiàn)癥感染，且PDCoV抗體檢測(cè)法尚未得到很好的驗(yàn)證，所以最好進(jìn)行病原檢測(cè)。雖然病原學(xué)檢測(cè)很多，但其他方法都有一定的缺陷，如病原分離鑒定要求高，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)臨床疾病的診斷不實(shí)用，膠體金檢測(cè)方法雖然檢測(cè)快速，但檢測(cè)敏感性低，且當(dāng)前市場(chǎng)上還未見(jiàn)PDCoV 檢測(cè)產(chǎn)品，產(chǎn)品的研制開(kāi)發(fā)需要一定的時(shí)間。相對(duì)而言，分子生物學(xué)檢測(cè)方法是最適合PDCoV 臨床疑似病例檢測(cè)的方法。雖然PDCoV 分子生物學(xué)檢測(cè)方法多樣，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR 方法雖然檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)，但不能定量，且檢測(cè)敏感性不高。熒光RT-PCR方法雖然克服了常規(guī)RT-PCR 的缺陷，但儀器和探針的合成價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本比較高，不適合基層應(yīng)用。LAMP 方法雖然簡(jiǎn)單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了免核酸提取熒光PCR擴(kuò)增技術(shù)、便攜式熒光PCR 儀器及除模板外PCR 組份凍干保存技術(shù)，如能應(yīng)用于PDCoV 分子檢測(cè)，必將開(kāi)發(fā)出更方便、快捷、成本更低的病毒分子檢測(cè)技術(shù)，方便疾病快速確診，從而更好做好PDCoV病的防控工作。進(jìn)行病料檢測(cè)時(shí)一定要選擇合適的病料樣品，對(duì)急性發(fā)病期的豬可選擇新鮮的糞便或唾液樣品檢測(cè)，從死亡豬只采集的空腸或回腸內(nèi)容物盡早送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不要采血清或全血樣本，要保證病料樣品的新鮮程度，采樣要具有代表性，多選幾份樣品，要把握采樣的時(shí)間，發(fā)病后期所采集的樣品可能檢測(cè)不到病毒。針對(duì)該病尚無(wú)有效的治療方法，國(guó)內(nèi)也無(wú)疫苗預(yù)防，確診后只能對(duì)癥治療，從生物安全方面進(jìn)行控制，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高豬只機(jī)體抗病力。豬舍加強(qiáng)保溫，保持豬舍清潔衛(wèi)生，做好消毒工作，定期通風(fēng)、降低氨氣濃度、減少飼養(yǎng)密度、減少應(yīng)激以降低PDCoV 病發(fā)病率和病情的嚴(yán)重程度。