巨核細(xì)胞發(fā)育和血小板生成的調(diào)控機(jī)理及巨核細(xì)胞和血小板的臨床應(yīng)用*

陳子興

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液研究所，衛(wèi)健委血栓與止血重點實驗室， 江蘇 蘇州 215006)

血小板是血液中行使凝血和止血功能的重要成分，近年來研究發(fā)現(xiàn)血小板還有日益增多的各種功能。血小板的數(shù)量和功能缺陷本身可導(dǎo)致某些疾病，而某些疾病中出現(xiàn)的血小板數(shù)量和功能缺陷，也嚴(yán)重影響疾病的預(yù)后。自1906年首次確認(rèn)血小板來源于巨核細(xì)胞后，血小板的各種病理改變就必然與巨核細(xì)胞的發(fā)育成熟過程密切相關(guān)。本文擬對造血系統(tǒng)中巨核細(xì)胞系列的發(fā)育成熟和血小板生成釋放的過程及其調(diào)控機(jī)理，以及在多種疾病中針對巨核細(xì)胞、血小板的靶向干預(yù)策略做一簡明扼要的綜述，使讀者獲得此領(lǐng)域比較全面綜合的理解。

1 巨核細(xì)胞發(fā)育分化和生成血小板的過程

巨核系祖細(xì)胞起源于由造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)定向分化的巨核-紅系雙向祖細(xì)胞(megakaryocyte-erythroid progenitor,MEP), 增殖的巨核系祖細(xì)胞終末分化成巨核細(xì)胞, 并實現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)的成熟和細(xì)胞核的核內(nèi)有絲分裂(endomitosis)，最后生成血小板。巨核細(xì)胞的成熟分化過程稱為巨核細(xì)胞生成(megakaryopoiesis)。 而由巨核細(xì)胞產(chǎn)生血小板并釋放的過程稱為血小板生成(thrombopoiesis)[1]。在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，初始巨核細(xì)胞(primitive megakaryocyte，pMk)分別在初始造血(primitive hematopoiesis)時的卵黃囊中和定型造血(definitive hematopoiesis)時的胚肝中出現(xiàn)，出生后在成人骨髓中產(chǎn)生。巨核細(xì)胞(megakaryocyte，Mk)起源于具有自我更新能力的多能造血干細(xì)胞定向分化而成的Mk祖細(xì)胞。早期Mk祖細(xì)胞是含有能產(chǎn)生Mk/血小板的HSC克隆和具有紅系/Mk雙向潛能的祖細(xì)胞克隆的異質(zhì)性群體。經(jīng)過數(shù)次細(xì)胞分裂分化成表達(dá)血小板特異性抗原(CD41/CD42)的原巨核母細(xì)胞(promegakaryoblast)。這些二倍體(2N)細(xì)胞通過多倍體化阻滯，擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)和形成更多細(xì)胞器，從有絲分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)換成核內(nèi)有絲分裂狀態(tài)而形成多倍體的巨核母細(xì)胞和巨核細(xì)胞，并重構(gòu)細(xì)胞骨架而形成偽足，成為原血小板(proplatelet)。成人巨核細(xì)胞分化發(fā)生在骨髓中，而血小板的形成和釋放發(fā)生在外周血和骨髓竇中，延伸的偽足狀原血小板通過內(nèi)皮屏障時斷裂成為血小板，這過程被認(rèn)為發(fā)生在肺循環(huán)血流中。

人類胚胎和新生兒的巨核細(xì)胞與成人巨核細(xì)胞在細(xì)胞的體積、細(xì)胞染色體的多倍體性、細(xì)胞分裂增殖的速度、表面抗原和細(xì)胞因子的表達(dá)以及產(chǎn)生血小板的效率等表型都有顯著區(qū)別[2]。血小板的產(chǎn)生與Mk的數(shù)量和體積有關(guān)。Mk通過核內(nèi)有絲分裂，即連續(xù)幾輪DNA復(fù)制而不分裂，成為多倍體(可達(dá)64N，一般形式為16N)而呈體積巨大并含有多分葉核的成熟巨核細(xì)胞，其主要結(jié)構(gòu)特征包括由分葉核之間胞膜內(nèi)折延展而成的分界膜系統(tǒng)(demarcation membrane system，DMS)，細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)展伴隨α和致密顆粒增多，致密的管網(wǎng)結(jié)構(gòu)形成開放管道系統(tǒng)以釋放顆粒。DMS作為生成原血小板的膜性儲存池與骨髓竇間隙相通，使分葉核節(jié)段化而最后加工成血小板，釋放到血流中。雖然巨核細(xì)胞是高倍體細(xì)胞，但高倍體并非產(chǎn)生血小板的先決條件，實驗證明胚胎中2N巨核細(xì)胞和臍血中的2N和4N巨核細(xì)胞都能產(chǎn)生血小板[1, 3]。

2 巨核細(xì)胞和血小板的生物學(xué)表型和功能

2.1巨核細(xì)胞的表型和功能 Mk直徑從胚胎的14～15 μm，逐步增大到成人骨髓Mk的21.9 μm。新生兒和嬰兒的Mk有較大和較小2個群體，發(fā)育到4歲的幼兒絕大多數(shù)就成為大Mk了。成人外周血中大于8N的Mk占40%，骨髓64N以上的Mk占68%，而Mk細(xì)胞分裂速度顯著降低，反映Mk核內(nèi)有絲分裂增強所致多倍體增多。雖然胚胎Mk體積增大和多倍體形成尚不充分，但其Mk/血小板特異性因子、細(xì)胞表面受體和Mk內(nèi)顆粒成分的表達(dá)已經(jīng)上調(diào)[2]。 胚胎和成人Mk表達(dá)的integrin α-IIb(CD41)、integrin β3(CD61)和糖蛋白Ib α(CD42b)水平相似, CD42b復(fù)合物代表著分化晚期的Mk細(xì)胞標(biāo)記。臍血來源的Mk祖細(xì)胞還表達(dá)大量的血小板蛋白血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和P-selectin。胚胎和成人Mk最大的表型差異是產(chǎn)生血小板的效率，成人外周血Mk產(chǎn)生原血小板和血小板的能力是臍血Mk的3倍。這種差異主要因為胚胎Mk體積小而多倍體化尚不足。

來自紅系/Mk雙向祖細(xì)胞的原始巨核細(xì)胞(megakaryoblast)經(jīng)過數(shù)次細(xì)胞分裂，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)即開始表達(dá)血小板特異性蛋白，如β1-tubulin,細(xì)胞膜表面逐漸出現(xiàn)一系列血小板特異性黏附蛋白，如integrin α-IIb /β3、integrin α-II/β1、GPIb和GPVI，細(xì)胞質(zhì)里出現(xiàn)組裝的顆粒內(nèi)含物，如PF4、TGF-β、vWF和P-selectin,產(chǎn)生原血小板的細(xì)胞內(nèi)膜開始形成。再經(jīng)過4～6次細(xì)胞分裂，有絲分裂開始停滯在分裂前期，出現(xiàn)核內(nèi)有絲分裂，導(dǎo)致Mk呈高度多倍體。在此期間，所有血小板特異性蛋白基因均同步化轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量血小板特異性關(guān)鍵蛋白。伴隨細(xì)胞內(nèi)膜的外鞘形成，肌動蛋白構(gòu)成的細(xì)胞骨架斷裂，β1-tubulin的長纖維伸出，原血小板分節(jié)段而成為血小板[1]。核內(nèi)有絲分裂所致的Mk高度多倍體對生成足量血小板非常關(guān)鍵，如果2N的Mk能產(chǎn)生2個血小板，經(jīng)過3次有絲分裂的16個2N Mk也僅產(chǎn)生32個血小板，而經(jīng)核內(nèi)有絲分裂產(chǎn)生的16N的Mk能產(chǎn)生多于2 000個血小板。由此可見，血小板數(shù)量和質(zhì)量異常，以及血小板功能蛋白的缺陷均可溯源至巨核細(xì)胞系列的發(fā)育過程。

2.2血小板的生物學(xué)表型和功能 血小板為血液中去核的細(xì)胞質(zhì)片狀結(jié)構(gòu),它雖然無細(xì)胞核，但攜帶充分的遺傳物質(zhì)(包括線粒體)，頻繁進(jìn)行各種生命活動并實施多樣生物學(xué)功能，除了凝血和止血外還包括參與抗微生物的宿主防衛(wèi)功能，分泌炎性細(xì)胞因子和幫助組織修復(fù)的細(xì)胞因子等。血小板從巨核細(xì)胞生成后，也會經(jīng)歷衰老、凋亡而被清除的過程，因此每天連續(xù)產(chǎn)生和清除1011血小板才能保持體內(nèi)血小板在(15～40)×104的穩(wěn)定水平。生成和清除過程之間的任何不平衡均會導(dǎo)致血小板數(shù)的過多或過少，而產(chǎn)生病理后果(出血或栓塞)。血小板的產(chǎn)生、存活和增殖的主要調(diào)控者是血小板生成素(thrombopoietin，TPO)及其介導(dǎo)的分子機(jī)理, 此外，骨髓微環(huán)境(龕位)也是影響血小板生成的重要因素。Mk細(xì)胞的成熟和血小板形成有賴于Mk細(xì)胞由成骨母細(xì)胞龕位移行到血管旁龕位。一旦Mk細(xì)胞成熟，就延伸出呈偽足狀突起的原血小板穿過髓竇內(nèi)皮細(xì)胞層的細(xì)胞間而斷裂成血小板進(jìn)入血流[4]。肝細(xì)胞為TPO的主要來源。血清TPO水平與血小板數(shù)呈負(fù)相關(guān)。動物模型顯示TPO通過結(jié)合Mk細(xì)胞和血小板表面的Mpl 受體及與之結(jié)合的JAK2和DNM2激活細(xì)胞內(nèi)通路，刺激雙向Mk祖細(xì)胞分化而產(chǎn)生血小板，同時又通過 Mpl限制TPO過度刺激而防止Mk細(xì)胞過度增生。調(diào)節(jié)血清TPO水平的還有其它多種因素，如血小板減少癥時骨髓基質(zhì)細(xì)胞會產(chǎn)生TPO，多種炎癥狀態(tài)(潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和卵巢癌等)也會增高血清TPO水平導(dǎo)致血小板增多。近年來研究突出了骨髓微環(huán)境對巨核細(xì)胞成熟和血小板產(chǎn)生的作用。成骨性龕位中的collagen I 與Mk表面integrin α-II /β1的相互作用抑制坐落于其中的Mk細(xì)胞產(chǎn)生血小板。隨著Mk細(xì)胞移行到血管旁龕位而成熟，它們與髓竇內(nèi)皮細(xì)胞相互作用生成穿越內(nèi)皮細(xì)胞間隙的原血小板，并最終形成血小板進(jìn)入血液循環(huán)。Mk細(xì)胞在龕位中的定位和移行由髓竇內(nèi)CXCL12和Mk細(xì)胞表面的CXCR4，以及內(nèi)皮細(xì)胞的VCAM-1和Mk細(xì)胞表面integrin α-IV /β1的相互作用來調(diào)節(jié)[4]。

血小板的清除可通過2種主要途徑，一是通過衰老誘導(dǎo)的信號來清除，即膜表面糖鏈的降解而啟動凋亡，血小板唾液酸酶Neu1和Neu3表達(dá)上調(diào)使血小板表面唾液酸丟失，特別消化vWF受體復(fù)合物GPIbα上糖鏈中的眾多唾液酸，使暴露的下層半乳糖殘基易于被金屬蛋白酶所降解而啟動凋亡。發(fā)生去唾液酸化而衰老的血小板，被肝細(xì)胞的Ashwell-Morrell受體清除，并由JAK2和STAT3信號通路介導(dǎo)反饋促進(jìn)肝臟合成TPO和增加血小板的生成。另一途徑是通過抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來清除。自身抗體所致的血小板清除最典型的發(fā)生在特發(fā)性血小板減少性紫癜，主要針對血小板表面的糖蛋白integrin α-IIb /β3(GPIIb-IIIa)和GPIb-IX復(fù)合物。破壞的血小板在脾臟由巨噬細(xì)胞，也可能在肝臟由Ashwell-Morrell受體清除之。

Mk細(xì)胞的存活有賴于Bcl-2家族蛋白MCL-1和BCL-XL對內(nèi)源性凋亡通路的有效管束。對MCL-1敲除小鼠模型，給予ABT-737(BCL-XL抑制劑)即促發(fā)巨核細(xì)胞快速凋亡。體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞凋亡有利于血小板的生成和釋放，血小板產(chǎn)生的峰值與成熟Mk細(xì)胞凋亡的峰值重合。小鼠模型顯示一旦巨核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)離散為血小板，Mk細(xì)胞就發(fā)生凋亡。血小板的生命期在人類是8～10 d，在小鼠是4～5 d。決定血小板生存期的決定因素是BCL-XL，其缺失顯著減少血小板的存活期，而與其下游BAK/BAX聯(lián)合缺失則延長血小板的存活期[5-6]。

近年來不斷增多的證據(jù)提示血小板還與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床前和臨床研究提示血小板通過與腫瘤細(xì)胞的各種相互作用可促進(jìn)腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞直接與血小板聚集，促發(fā)血小板顆粒釋放，改變血小板的表型和RNA表達(dá)譜，促進(jìn)血小板增多。反之，血小板推動腫瘤細(xì)胞的增殖，激活抗凋亡和血管生成信號通路，并通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型而激發(fā)腫瘤細(xì)胞的侵襲，維持其轉(zhuǎn)移灶，并促進(jìn)形成新的轉(zhuǎn)移灶。這為阿司匹林等抗血小板藥物在腫瘤治療中提供了理論可能[7]。

3 調(diào)控巨核細(xì)胞發(fā)育成熟和血小板產(chǎn)生的分子機(jī)理

巨核紅系祖細(xì)胞定向于巨核細(xì)胞系列而終末分化成能產(chǎn)生血小板的成熟巨核細(xì)胞的整個過程都受到嚴(yán)格的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和表觀遺傳學(xué)機(jī)理的掌控, 而外部刺激的信號通路則啟動和協(xié)調(diào)這些調(diào)控步驟。巨核祖細(xì)胞的定向分化過程至少有6種轉(zhuǎn)錄因子——GATA-1、GATA-2、Fli-1、RUNX1、FOG-1和 NF-E2發(fā)揮關(guān)鍵作用,它們參與調(diào)控巨核細(xì)胞系列特異性基因的表達(dá)而使之成熟形成血小板。其中GATA-1不但使初始多能祖細(xì)胞定向于紅/巨核系雙向祖細(xì)胞，還調(diào)控巨核細(xì)胞的發(fā)育分化，如顆粒和DMS形成。巨核細(xì)胞中，integrinα-IIb、GPIb,GPVI,GPIX和PF4基因啟動子中都有供GATA-1和ETs 族轉(zhuǎn)錄因子(如FLi-1)結(jié)合的共有序列。RUNX1(即AML1或CBFα)的活性由多種信號途徑(如MAPK)修飾調(diào)控，一旦激活，它與CBFβ組成的復(fù)合物就結(jié)合到共有序列TGTGNNN,促進(jìn)多種巨核細(xì)胞特異基因(PF4，integrin α-IIb) 的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)細(xì)胞增殖。NF-E2在巨核細(xì)胞成熟的最后階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。另外一些轉(zhuǎn)錄因子則經(jīng)由系統(tǒng)生物學(xué)分析獲知, 如c-Myb 對MEP是定向于紅系還是巨核系起決定性作用。 這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平主要由內(nèi)源性信號決定。組蛋白乙?；图谆閷?dǎo)的表觀遺傳學(xué)也影響著巨核細(xì)胞的基因表達(dá)態(tài)勢，例如FOG的突變阻斷轉(zhuǎn)錄因子與核小體重塑和去乙?；笍?fù)合物NuRD的相互作用，而導(dǎo)致灰色血小板綜合征樣的巨大血小板減少癥。TPO與巨核細(xì)胞表面的受體c-Mpl結(jié)合后，激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)巨核細(xì)胞的存活、增殖和分化，這些信號途徑包括MAPK、STAT、PI3K、PTEN、SHP1、SHP2和SHIP1以及細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子蛋白。 此外, 還有更多的信號分子參與, 包括mTOR、β-catenin和G蛋白Rac1、Rho和CDC42,轉(zhuǎn)錄因子HIF-α、HOXB4和HOXA9, 以及下調(diào)的介導(dǎo)分子GSK3-α 和FOXO3[1, 8]。Mk核內(nèi)有絲分裂而多倍體化的調(diào)控還涉及轉(zhuǎn)錄因子(如GATA-1、TAL-1、FOG-1、RUNX1、GFI1b和 NF-E2)，細(xì)胞周期調(diào)控分子，如cyclin D、E，以及CDK抑制分子(P27KIP1、P15INK4B、P19INK4D、P57KIP2)、aurora B、RhoA和 myosin IIB(MYH10)等。應(yīng)用ChIP-seq分析臍血中巨核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子GATA-1/2、RUNX1、Fli1和 SCL在基因組中的結(jié)合位點，確認(rèn)march2、max、smox、pttg1lp、emilin1和sufu基因?qū)藓思?xì)胞生成和發(fā)育具有關(guān)鍵作用[1, 9]。

巨核細(xì)胞與HSCs有許多相似的特征，其中最令人關(guān)注的是兩者的維持和擴(kuò)增都依賴于TPO-MPL信號通路的作用，兩者還有相同的表面抗原，如CXCR4 和CD150，并有類似的基因表達(dá)態(tài)勢，表明HSCs與紅/巨核系祖細(xì)胞具有最密切的關(guān)系。單細(xì)胞分析揭示HSCs中有一群高表達(dá)vWF的HSC, 可能是最易于定向巨核細(xì)胞系列的細(xì)胞。最近的實驗發(fā)現(xiàn)巨核細(xì)胞對HSC在龕位中保持靜息發(fā)揮重要作用，在受外部刺激應(yīng)激時(如化療后)，巨核細(xì)胞還可能對HSC有反饋作用而促進(jìn)HSCs的增殖和恢復(fù)[10]。

4 巨核細(xì)胞系列發(fā)育成熟和血小板生成的表觀遺傳調(diào)控

紅系/巨核系祖細(xì)胞定向于巨核系發(fā)育分化中，系列特異性基因的表達(dá)除了受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，還受基因順式元件(如啟動子，增強子)的染色質(zhì)構(gòu)型開放性和可及性，以及miRNAs等表觀遺傳學(xué)機(jī)理的調(diào)控。Heuston等[11]對小鼠和人多潛能祖細(xì)胞(multipotent progenitor,MPP)、紅系/Mk祖細(xì)胞和Mk定向祖細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)錄組和全基因組中開放型染色質(zhì)H3K27ace的分布譜，顯示Mk定向祖細(xì)胞與MPP非常相近，巨核系列基因表達(dá)譜和表觀基因組景觀在造血發(fā)育的早期就建立并存在于絕大多數(shù)MPP中。相比之下，紅系表達(dá)譜和表觀基因組在造血過程的晚期，對MPP的轉(zhuǎn)錄和表觀基因組編程有較大改變后才確立。人類白細(xì)胞某些基因的甲基化態(tài)勢改變與血小板的功能相關(guān)，最典型的例子是復(fù)雜印記基因簇GNAS的甲基化狀態(tài)與血小板刺激G-蛋白(Gs)激活功能之間的關(guān)系。Gs由復(fù)雜印記基因簇GNAS編碼，GNAS覆蓋的3段甲基化區(qū)域分別來自父源和母源特異性表達(dá)的印記基因。GNAS區(qū)域的遺傳或表觀遺傳異常導(dǎo)致一系列奇特表型的遺傳病，如Albright 遺傳性骨萎縮癥、假性甲旁腺功能低下癥Ia型及Ib型和雙假性甲旁腺功能低下癥，均伴有血小板Gs功能減退。這些GNAS甲基化態(tài)勢異常而致的遺傳病，因血小板Gs低功能而易聚集，可導(dǎo)致低齡缺血性腦卒中和心血管病[12]。

巨核細(xì)胞系列的分化還與染色質(zhì)組蛋白的修飾有關(guān)，體外以組蛋白脫乙?；?histone deacetylase，HDAC) 泛抑制劑誘導(dǎo)CD34+HSC向巨核細(xì)胞系列分化時，Mk細(xì)胞的多倍體性顯著下降，成熟缺陷，這提示HDAC既可能參與調(diào)控Mk細(xì)胞的核內(nèi)有絲分裂所致的多倍體化，也可能與某些細(xì)胞骨架蛋白(如α-tubulin)的乙?；嘘P(guān)?；蛱蕹∈竽Ｐ瓦€顯示Asxl1、Tet2和Ezh2基因也與Mk系列的分化有關(guān)[9]。最近Yang 等[13]報告，作為使H3K9me2去甲基化的組蛋白去甲基酶JmjC家族的成員，PHF2也參與了紅/巨核系列分化的表觀遺傳調(diào)控。

多種微小RNA(microRNA, miRNAs)參與巨核細(xì)胞生成和分化調(diào)控。miR-125b通過靶向作用于P19INK4D而參與巨核細(xì)胞的分化調(diào)控[14]。 miR-150靶向降低c-Myb表達(dá)而促使紅/巨核系祖細(xì)胞向巨核細(xì)胞方向分化。Mk的成熟分化與miR-150的表達(dá)負(fù)相關(guān)。TPO刺激巨核細(xì)胞增殖時，miR-150表達(dá)水平上調(diào)。巨核細(xì)胞生成中起作用的還有miR-34a和 miR-27a。有研究者應(yīng)用miRNA芯片還篩選到巨核細(xì)胞生成過程中miR-10a、miR-126、miR-106、miR-10b、miR-17和 miR-20表達(dá)下調(diào)。

5 巨核細(xì)胞系列調(diào)控機(jī)理異常所致血小板數(shù)量和功能異常的病理改變

巨核細(xì)胞發(fā)育分化過程的調(diào)控機(jī)制異常，導(dǎo)致產(chǎn)生的血小板數(shù)量和功能缺陷，從而產(chǎn)生與止血或血栓相關(guān)的病理改變，主要可分為家族遺傳性血小板功能異常和惡性巨核細(xì)胞/血小板病兩大類。最主要的巨核細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)控機(jī)理的異常是轉(zhuǎn)錄因子突變造成的功能改變，而多種轉(zhuǎn)錄因子的突變既可導(dǎo)致家族遺傳性血小板功能異常，又可導(dǎo)致惡性巨核細(xì)胞/血小板病。這些發(fā)生突變的轉(zhuǎn)錄因子包括RUNX1、Fli-1、GATA1、GFI1b、ETV6和 EVI1等。近年來應(yīng)用二代測序(next generation sequencing，NGS)檢測基因組景觀的變化更深入地揭示了巨核細(xì)胞/血小板病理改變的分子機(jī)理。

5.1轉(zhuǎn)錄因子的突變所致的家族遺傳性血小板功能異常和惡性血液病易感性RUNX1編碼蛋白(即CBFα2、AML1)是調(diào)控胚胎定型造血不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子，它與CBFβ 組成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物調(diào)控一批Mk/血小板通路的基因(如ALOX12、PF4、MPL、MYH9和MYH10等)。RUNX1條件敲除小鼠模型的Mk分化成熟受損，出現(xiàn)異常的微巨核細(xì)胞和多倍體程度顯著下降。RUNX1突變的患者血小板減少，聚集功能受損，有輕中度出血傾向，如出現(xiàn)更多基因(如CDC25C、GATA2、TET2、MLL2和RB1)的體細(xì)胞突變，預(yù)示著向急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia,AML)/骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)的惡性轉(zhuǎn)化。RUNX1胚系突變可導(dǎo)致家族遺傳性血小板功能異常，并顯示AML/MDS的易感性[15-16]。

Fli-1基因?qū)儆贓TS族轉(zhuǎn)錄因子的成員，在巨核細(xì)胞生成發(fā)育和血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Fli-1敲除小鼠的胚胎死于出血。Fli-1缺損與Jacobsen syndrome (JS) / Paris-Trousseau syndrome(PTS)相關(guān)。此缺損可由親本配子的原發(fā)突變產(chǎn)生，也可由染色體重排而基因易位所致。前者具有古怪面容，發(fā)育遲緩，多器官(心、腎、泌尿生殖道，神經(jīng)和造血系統(tǒng))異常。大部分JS者合并PTS，有出血傾向，先天性巨血小板減少癥和血小板功能異常。骨髓中巨核細(xì)胞增多，出現(xiàn)小幼稚Mk細(xì)胞。近年用NGS還發(fā)現(xiàn)Fli-1可有不同點突變的變異體。

GATA1基因編碼的鋅指轉(zhuǎn)錄因子對紅細(xì)胞生成和巨核細(xì)胞生成均起關(guān)鍵作用，它在紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞，肥大細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞中都高表達(dá)。巨核細(xì)胞內(nèi)許多基因的調(diào)控區(qū)都有GATA1結(jié)合模序。在多個出現(xiàn)別關(guān)性的聯(lián)血小板和紅細(xì)胞異常而表現(xiàn)為貧血和血小板減少的家族中檢出GATA1不同形式的突變，如GATA1-V205M、D218Y、D218G和G208S等，破壞GATA1與FOG1相聯(lián)或阻礙其結(jié)合到DNA上。β地中海貧血中的GATA1突變可致性別關(guān)聯(lián)的血小板減少。有GATA1突變患者對膠原反應(yīng)的血小板聚集降低，對瑞斯托酶素的凝集反應(yīng)降低，GPVI及GPIb-IX-V復(fù)合物的表達(dá)減低。

鋅指轉(zhuǎn)錄因子GFI1b通過對染色質(zhì)構(gòu)型實施調(diào)控而抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，對紅細(xì)胞生成和巨核細(xì)胞生成發(fā)揮關(guān)鍵作用，它表達(dá)于HSC, MEP和紅、巨核兩系列成熟細(xì)胞上。通過調(diào)控TGF-β信號通路控制MEP的系列特異性分化。GFI1b調(diào)控轉(zhuǎn)錄的靶基因有BCL-xL、SOCS1、SOCS3、CDKN1A、GATA3、MEIS1和RAG1/2。近年發(fā)現(xiàn)家族性GFI1B突變與血小板功能異常相關(guān)。GFI1b突變者呈輕中度血小板減少和不同程度的出血傾向，血小板聚集功能受損，GPIbα和GPIIIa表達(dá)下降。骨髓顯示巨核細(xì)胞病態(tài)特征，巨核細(xì)胞/血小板表達(dá)的CD34增高[15]。

ETV6編碼的轉(zhuǎn)錄因子屬于ETS家族，其功能主要是抑制轉(zhuǎn)錄。ETV6對造血和血管網(wǎng)絡(luò)形成有關(guān)鍵作用，ETV6敲除小鼠出現(xiàn)胚胎卵黃囊血管形成受損和神經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞凋亡。ETV6支持HSC的存活，對巨核細(xì)胞的終末分化也很重要，純合ETV6條件敲除小鼠的血小板數(shù)下降一半。雜合性ETV6胚系突變的家族出現(xiàn)遺傳性血小板減少，巨大紅細(xì)胞和惡性血液病。 Poggi等[17]對顯性的血小板減少患者的細(xì)胞行DNA測序，檢出6種ETV6變異體，它們可導(dǎo)致巨核細(xì)胞中原血小板的形成減少和細(xì)胞骨架異常，血小板體積和形狀參差不齊，功能缺陷，患者伴有頑固性貧血和外周循環(huán)CD34+的祖細(xì)胞數(shù)增高。

鋅指蛋白EVI1由位于染色體3q26.2上的MDS1/EVI1復(fù)合位點MECOM編碼，其鋅指結(jié)構(gòu)可識別GATA樣和ETS樣的模序, 可與其它轉(zhuǎn)錄因子(RUNX1和GATA-1)相互作用。EVI1表達(dá)于HSC、Mk和血小板上，對HSC的自我更新具有根本的作用。EVI1敲除小鼠因出血、造血細(xì)胞稀少和基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞而胎死宮內(nèi)；敲低HSCEVI1損害巨核細(xì)胞的分化，下調(diào)ITGA2b和ITGB3的表達(dá)。由MECOM突變而致EVI1蛋白異常的家族出現(xiàn)先天性橈尺骨骨性關(guān)節(jié)炎和巨核細(xì)胞性血小板減少癥(radioulnar synostosis and amegakaryocytic thrombocytopenia，RUSAT):患者的尺撓骨先天融合，血小板重度減少，Mk顯著減少甚至在骨髓中消失，患者最終骨髓衰竭而需造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplant，HSCT)挽救。某些患者還有HOXA11突變。在5%～10% AML患者中出現(xiàn)MECOM突變，成為預(yù)后不良標(biāo)記。

除了上述轉(zhuǎn)錄因子基因的突變外，轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合的調(diào)控序列發(fā)生突變使RUNX1、Fli-1或 GATA1等轉(zhuǎn)錄因子不能與之結(jié)合，也會產(chǎn)生臨床血小板減少。

5.2惡性巨核細(xì)胞/血小板病的基因組改變 多種惡性血液病或惡性血液病的前期即發(fā)生Mk和血小板異常，這些異常參與或反映了惡性血液病的發(fā)生機(jī)理并影響或成為疾病的預(yù)后指標(biāo)。其次Mk系列本身的惡性轉(zhuǎn)化就產(chǎn)生急性白血病。近年NGS等技術(shù)揭示這些涉及Mk和血小板異常的惡性血液病的基因組改變，以及Mk和血小板異常在這些疾病中的作用。

首先是Ph-MPN(骨髓增殖性疾病)，有進(jìn)展為AML的高風(fēng)險。按WHO分類為PV、ET和PMF，其中PV主要涉及紅細(xì)胞系列增多，ET和PMF的臨床表現(xiàn)都涉及巨核細(xì)胞系列和血小板的異常，前者血小板增多,巨核細(xì)胞明顯增殖而骨髓中無纖維化，而后者骨髓中巨核細(xì)胞過多并呈病態(tài)，伴有網(wǎng)狀纖維和膠原纖維沉積。95% ET和50%～60% PMF中最主要涉及的基因組改變是體細(xì)胞獲功能的點突變JAK2V617F，導(dǎo)致JAK2介導(dǎo)的TPO、EPO和C-CSF受體信號途徑持續(xù)活化而不依賴于細(xì)胞刺激因子；其次是MPL的獲功能體細(xì)胞突變(MPLW515L,MPLW515K),使巨核細(xì)胞不依賴細(xì)胞因子而對TPO高度敏感。還有編碼Calreticulin的CALR基因也在約30%的ET或PMF中突變，其突變使CALR蛋白失去在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位。突變的CALR通過MPL體質(zhì)性地激活JAK-STAT通路，對 TPO高度敏感，導(dǎo)致巨核細(xì)胞群體擴(kuò)張和血小板增多而類似ET。雖然大部分MDS患者血小板減少，5q-MDS患者的血小板計數(shù)卻正常或增高，骨髓巨核細(xì)胞呈低分葉。 RARS-T是MDS和MPN中的一種較少見的表現(xiàn)，特點為病態(tài)紅細(xì)胞伴有>15%環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞，血小板增多和大型巨核細(xì)胞增殖。70%～90%的RARS-T都有RNA剪切基因SF3B1的突變，該基因編碼的SF3B1是U2snRNP剪切子復(fù)合物的基本成分而參與RNA加工。在MPN中SF3B1突變的發(fā)生早于JAK、MPL和CALR突變。

急性巨核細(xì)胞型白血病(acute megakaryoblastic leukemia，AMKL)是AML的亞型之一，骨髓中出現(xiàn)原始巨核細(xì)胞和相當(dāng)程度的纖維化，復(fù)雜染色體核型在AMKL中多見，如t(9;22)、-5/del5q、-7/del7q等，AMKL發(fā)病還與GATA1突變和DYRK1A、ERG、miR-125b的過表達(dá)相關(guān)[8]。

5.3遺傳性血小板異常(inherited platelet disorders，IPD)的基因組異常 遺傳性血小板異常通常表現(xiàn)為血小板數(shù)量和體積的改變，伴隨血小板功能缺陷，包括血小板的黏附功能、聚集功能、凝集功能和應(yīng)答生長刺激因子的受體和信號通路的缺陷等，其中Bernard-Soulier syndrome(BSS)是一種少見的血小板減少伴巨大血小板的病變，有血小板黏附功能缺陷所致的出血傾向。其血小板GPIb-IX-V復(fù)合物表達(dá)的質(zhì)和量，及其與vWF結(jié)合能力缺損，綜合基因組分析顯示GPIBA、GPIBB或GP9基因位點共有112處突變，損害GPIb-IX-V復(fù)合物的組裝。血小板分泌和聚集的信號通路缺陷可導(dǎo)致輕中度出血，其中編碼G蛋白偶聯(lián)受體GPCR蛋白的P2Y12、TBXA2R基因突變減弱了ADP或TBXA2誘導(dǎo)的血小板聚集。血小板中α和δ顆粒分泌的蛋白觸發(fā)血小板的黏附和止血，而灰色血小板綜合征是α顆粒分泌和蛋白包裝儲存缺陷的IPD，有輕中度出血、骨髓纖維化和脾腫大。NBEAL2基因突變被認(rèn)為是其分子機(jī)理, 與紅/巨核分化調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子GFI1b基因的無義突變也與伴紅細(xì)胞缺損的灰色血小板綜合征相關(guān)。與δ顆粒分泌、穿梭和釋放缺陷相關(guān)的出血分別出現(xiàn)在Hermansky-Pudlak syndrome(HPS)和Chediak-Higashi syndrome(CHS)患者中，分別與編碼合成溶酶體相關(guān)復(fù)合物的HPS1、HPS3-9、AP3B1基因缺損，以及LYST基因的移碼或無義突變有關(guān)。活化血小板表面的integrinαIIbβ3(GPIIb、GPIIIa)與纖維蛋白原和其它黏附蛋白結(jié)合使血小板聚集。 血小板無力癥(Glanzmann thrombasthenia，GT)患者編碼GPIIb和GPIIIa的ITGA2B和ITGA3基因發(fā)生雙等位位點突變，影響血小板聚集而導(dǎo)致嚴(yán)重出血。Phosphatidylserine由TMEM16F基因編碼，在血管損傷時暴露而促發(fā)與凝血因子結(jié)合，最終產(chǎn)生凝血酶而形成纖維蛋白凝血塊。在罕見的家族性出血病Scott syndrome患者有TMEM16F基因純合或雜合性突變，影響Phosphatidylserine血小板膜表面的外化而損害凝血過程[8]。隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)的開展，過去30年來，共確認(rèn)了51個基因的變異與IPD的發(fā)生有關(guān)，這些基因變異發(fā)生在巨核細(xì)胞早期定向分化、晚期分化成熟和原血小板生成3個階段，影響血小板的生物表型或功能[18]。胚細(xì)胞中RUNX1基因突變與家族遺傳性血小板異常相關(guān)，并伴有髓系惡性疾病的易感性，往往會進(jìn)展為MDS/AML[16]。

6 以巨核細(xì)胞和血小板為靶點或介導(dǎo)載體的臨床應(yīng)用策略

6.1巨核系祖細(xì)胞的識別和分離 近年來巨核細(xì)胞和血小板被臨床應(yīng)用作為對某些疾病治療的靶點或運載工具。而其前提首先是識別和分離巨核細(xì)胞。與理論上經(jīng)典的紅/巨核系祖細(xì)胞不同，Miyawaki等[19]以CD41為陽性標(biāo)記在CD34+CD38+IL-3RαdimCD45RA-的CMP群體中分選出單向巨核系祖細(xì)胞MegP,能高頻率地活躍分化成巨核系列細(xì)胞，比經(jīng)典紅/巨核系祖細(xì)胞的效率高得多，在ET中含JAK突變的CD41+MegP群體顯著擴(kuò)張。這就為臨床應(yīng)用前的實驗操作提供了可分離的巨核祖細(xì)胞群體。Brouard等[20]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，小鼠胚肝中含CD45-CD31-TER119-CD51+VCAM1+PDGFRα-(V+P-) 標(biāo)記的基質(zhì)細(xì)胞群體提供的微環(huán)境能有效支持巨核祖細(xì)胞的產(chǎn)生和克隆擴(kuò)張。與V+P-細(xì)胞共培養(yǎng)所得的巨核細(xì)胞呈多倍體性，含CD41/42c+,并能產(chǎn)生大量原血小板。

6.2以巨核細(xì)胞為對象的基因干預(yù)和治療 對巨核細(xì)胞和血小板的應(yīng)用主要有以下策略：以分離到的MegP行體外實驗，研究促進(jìn)巨核系細(xì)胞分化和糾正血小板異常的基因干預(yù)操作和臨床前研究，來改進(jìn)許多疾病的狀況。鑒于血小板參與多種生理過程，如止血、免疫反應(yīng)和創(chuàng)傷愈合；也參與多種疾病的病理機(jī)制，如動脈硬化、血栓形成和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；而無細(xì)胞核的血小板只有被血管損傷等應(yīng)激環(huán)境激活后才發(fā)揮功能，因此要對血小板的缺陷功能進(jìn)行糾正或改造，必須對其源頭(HSC、HPC或巨核細(xì)胞)細(xì)胞實施基因操作，且需考慮這些血小板中功能基因表達(dá)的最佳時間。有一批巨核細(xì)胞特異性基因的啟動子可供轉(zhuǎn)入的外源目的基因?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄，這些基因包括GPIBA-GPIX-GPV復(fù)合物、ITGA2B(GPIIb)、GPVI、c-mpl和PF4。這些啟動子在巨核細(xì)胞早、中期由轉(zhuǎn)錄因子GATA-1、FOG-1、Ets(Fli-1)結(jié)合而實施基因表達(dá)的調(diào)控。它們驅(qū)動的基因在巨核細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)到高水平，因此很適合驅(qū)動外源基因在巨核細(xì)胞中的表達(dá)，而對HSC或巨核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)目前以慢病毒載體為最適。

以上述策略靶向巨核細(xì)胞的基因治療，旨在糾正基因缺損所致的家族遺傳性血小板病，例如Scott syndrome中的TMEM16F，Stormorken syndrome中的STIM1/ORAI，Wiskott-Aldrich syndrome中的WASP和GP syndrome中的GFI1b[21]。對2例GT患者實施的基因治療，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)將以ITGA2B啟動子驅(qū)動的正常ITGB3cDNA轉(zhuǎn)入患者CD34+PBSC中，使之在19%后代巨核細(xì)胞中表達(dá)出正常水平39%的integrin αIIβ3受體，足以糾正患者的出血癥狀，成功展示了以基因置換策略治療遺傳性血小板病的可行性[22]。近來又報導(dǎo)了對iPSC轉(zhuǎn)基因治療GT的策略。對血友病A應(yīng)用AAV載體介導(dǎo)對HSC實施FVIII轉(zhuǎn)基因的治療在動物模型中取得止血效果。有人嘗試用巨核細(xì)胞特異性ITGA2B啟動子構(gòu)建含F(xiàn)VIII或vWF的慢病毒載體對血友病A動物實施轉(zhuǎn)基因HSC移植，結(jié)果顯示血小板表達(dá)的FVIII儲存在α顆粒內(nèi)并釋放，糾正了血友病A動物的出血。當(dāng)前靶向巨核細(xì)胞的基因治療還面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，包括轉(zhuǎn)基因的巨核細(xì)胞可能影響血小板的產(chǎn)生和改變血小板部分功能，對巨核細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因可能造成不可預(yù)測的插入性突變，導(dǎo)致機(jī)體對轉(zhuǎn)基因巨核細(xì)胞的免疫反應(yīng)等，有待克服和改進(jìn)。

6.3以血小板介導(dǎo)的對腫瘤診斷和治療策略 以血小板為載體可釋放抗腫瘤(抗血管生成)分子到腫瘤微環(huán)境中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有報告對腫瘤患者輸以預(yù)載了化療藥物或納米顆粒的血小板獲得肯定的結(jié)果；又有報告以CMV啟動子驅(qū)動抗血管新生蛋白tumstatin基因表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+HSCs后，成功分化的巨核細(xì)胞能合成外源tumstatin并存儲于血小板α顆粒而釋放之，在體外對肺癌細(xì)胞有抗血管生成的效應(yīng)[21]；以腫瘤細(xì)胞共育的血小板可作為非侵入性分子指標(biāo)在液態(tài)活檢中檢出腫瘤并監(jiān)測腫瘤的進(jìn)展[23]；血小板來源的微顆粒(platelet-derived microparticles，PMPs)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，循環(huán)中的PMPs可與腫瘤(血管)細(xì)胞相互作用而將血小板miRNAs傳遞給腫瘤細(xì)胞。Michael等[24]展示PMPs可浸潤到人或鼠的實體瘤灶中，在體內(nèi)或體外將miRNA(主要是miR-24)傳遞給腫瘤細(xì)胞(肺或大腸)而抑制細(xì)胞增殖并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，表明血小板可作為介導(dǎo)抗腫瘤物質(zhì)的運載工具。

7 結(jié)語

巨核細(xì)胞和血小板是整個造血系統(tǒng)的重要成分，具有特殊的重要生理功能，也參與許多嚴(yán)重疾病的病理過程。相對于紅系和髓系造血細(xì)胞的研究，目前對此領(lǐng)域的研究尚不夠充分，有待更系統(tǒng)和深入的研究，近年來對它們的功能有許多新認(rèn)識。希望本文引起讀者對巨核細(xì)胞血小板系統(tǒng)發(fā)育分化機(jī)理和相關(guān)疾病的興趣和關(guān)注，以推動此領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化。