銀葉鳳尾蕨化學成分的研究

鄒 娟，趙臣亮，何 康，譚宏燕，張敬杰，潘爐臺

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025）

銀葉鳳尾蕨Pteris creticavar.silvestris為歐洲鳳尾蕨的變種，目前僅發(fā)現于貴州紫云縣，是鳳尾蕨科鳳尾蕨屬多年生常綠草本植物［1］。歐洲鳳尾蕨全草入藥，具有清熱利濕、活血止痛的功效，貴州民間用于治療跌打損傷、腹痛、黃疸、痢疾、淋證、水腫、燒燙傷以及犬蛇咬傷等［2］，銀葉鳳尾蕨在民間常作歐洲鳳尾蕨的替用藥，其化學成分未見報道。國外學者先后對日本、意大利等地的歐洲鳳尾蕨化學成分做了相關研究［3-7］，發(fā)現其主要含二萜、三萜和黃酮類；王慧娟［8］等對歐洲鳳尾蕨提取物的藥理進行研究，發(fā)現其具有較好的抗菌活性。為對鳳尾蕨屬植物綜合開發(fā)利用，探究其生理活性成分，本課題組對貴州紫云產銀葉鳳尾蕨進行化學成分研究。從中分離得到12 個化合物，均為首次從該植物中分離得到。研究表明，化合物1、4 具有一定的腫瘤細胞毒活性［9］，化合物3 對NCIH1650、HepG2、BGC-823、HCT-116、A2780 等多種腫瘤細胞具有較好的抑制活性［10］；化合物6 具有抗炎及抗腫瘤活性［11-12］。

1 材料

Q-TOF 質譜儀（德國Bruker 公司）；Inova-400 MHz 核磁共振儀（美國Varian 公司）；Agilent 1100分析、半制備型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；R215 旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 實驗室儀器公司）；FZ102 微型植物粉碎機（上海書培實驗設備有限公司）；電子天平（瑞士Metter-Toledo 公司）；Sephadex LH-20（美國通用電氣醫(yī)療集團）；P-1 型薄層層析色譜展開缸（雙槽立式，上海江儀儀器有限公司）；GF254制備薄層板及200～300 目柱色譜用硅膠（青島海洋化工有限公司）。所用試劑均為分析純。藥材于2014 年7 月采自貴州省紫云縣，經貴州中醫(yī)藥大學趙俊華教授鑒定為鳳尾蕨科鳳尾蕨屬植物銀葉鳳尾蕨Pteris creticavar.silvestris，植物標本存放于貴州中醫(yī)藥大學。

2 提取與分離

自然干燥的銀葉鳳尾蕨葉29.3 kg 粉碎成粗粉（60～80 目），90% 甲醇冷浸法提取4 次（每次5 d），過濾提取液，減壓回收甲醇后得浸膏2.6 kg。加水溶解后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，減壓濃縮3 個部分萃取液，分別得浸膏0.5、1.3、0.8 kg。

石油醚部分進行硅膠柱層析，石油醚-二氯甲烷（100∶1～0∶100）梯度洗脫，TLC 檢測后，將極性相近部分進行分段，得到2 個組分Fr.A-Ⅰ（278 g）、Fr.A-Ⅱ（127 g）。Fr.A-Ⅱ組分經石油醚-二氯甲烷（10∶1～0∶10）系統(tǒng)梯度洗脫，抽濾后用Sephadex LH-20 進行純化，得化合物8（13 mg）。

二氯甲烷部分進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～0∶100）梯度洗脫，得4 個組分Fr.B-Ⅰ（168 g）、Fr.B-Ⅱ（175 g）、Fr.B-Ⅲ（288 g）、Fr.B-Ⅳ（235 g）。Fr.B-Ⅱ組分進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得5 個組分Fr.B-Ⅱ-1（23 g）、Fr.B-Ⅱ-2（18 g）、Fr.B-Ⅱ-3（22 g）、Fr.B-Ⅱ-4（25 g）、Fr.B-Ⅱ-5（15 g）。Fr.B-Ⅱ-2、Fr.B-Ⅱ-4 分別用硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（95∶5～0∶100），甲醇重結晶后得化合物1（3.2 g）、9（2.6 g）；Fr.B-Ⅱ-3 經硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，經Sephadex LH-20 純化，得化合物5（20 mg）、6（17 mg）。Fr.B-Ⅲ組分進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100∶1～0∶100），得3 個組分Fr.B-Ⅲ-1（33 g）、Fr.B-Ⅲ-2（89 g）、Fr.B-Ⅲ-3（62 g）。其中，Fr.B-Ⅲ-1 組分經硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度洗脫（10∶1～0∶10），Sephadex LH-20 純化后得化合物2（88 mg）、3（48 mg）、12（19 mg）。

乙酸乙酯部分進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～0∶100）梯度洗脫，得4 個組分Fr.C-Ⅰ（68 g）、Fr.C-Ⅱ（105 g）、Fr.C-Ⅲ（188 g）、Fr.C-Ⅳ（135 g）。Fr.C-Ⅱ組分用硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100∶1～0∶100）后，結合凝膠及半制備HPLC 色譜儀得化合物7（14 mg）；Fr.C-Ⅲ組分經硅膠柱層析，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脫（100∶1～0∶100）后，甲醇重結晶得化合物4（34 mg）；Fr.C-Ⅳ組分用硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100∶1～0∶100）后，經半制備HPLC 色譜儀多次分離，得化合物10（15 mg）、11（19 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：乳白色粉末（甲醇）。10%硫酸-乙醇溶液加熱顯粉紫色。EI-MSm／z：306［M］+，結合碳譜數據，推測其分子式C20H34O2，不飽和度4。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：3.94（1H，m，H-2），1.35（3H，s，H-17），1.19（1H，m，H-9），1.04（3H，s，CH3-20），0.91（3H，s，CH3-18），0.83（3H，s，CH3-19），0.78（1H，m，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：49.6（C-1），65.3（C.-2），51.3（C-3），35.0（C-4），56.7（C-5），26.9（C-6），41.9（C-7），45.3（C-8），55.7（C-9），41.1（C-10），18.2（C-11），20.2（C-12），49.1（C-13），37.8（C-14），57.9（C-15），79.3（C-16），24.6（C-17），33.7（C-18），22.5（C-19），18.9（C-20）。以上數據與文獻［13］基本一致，故鑒定為2β，16α-diol-ent-kaurane。

化合物2：無色晶體（吡 啶），mp 216～218 ℃。10% 硫酸-乙醇溶液加熱顯紫色。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.22（1H，s，H-17a），5.17（1H，s，H-17b），4.02（1H，m，H-2），3.99（1H，dd，J=9.8，3.0 Hz，H-6），3.92（1H，s，H-15），2.64（1H，m，H-13），2.05（1H，d，J=11.2 Hz，H-7），1.91（2H，d，J=14.6 Hz，H-12），1.23（3H，s，CH3-18），1.05（3H，s，CH3-19），0.99（3H，s，CH3-20）；13CNMR（100 MHz，C5D5N）δ：51.6（C-1），64.3（C-2），54.8（C-3），36.5（C-4），61.2（C-5），68.5（C-6），46.1（C-7），48.5（C-8），55.0（C-9），43.2（C-10），18.9（C-11），33.6（C-12），42.4（C-13），37.5（C-14），83.4（C-15），161.8（C-16），109.0（C-17），37.8（C-18），24.0（C-19），20.5（C-20）。以上數據與文獻［14-17］基本一 致，故 鑒 定 為2β，6β，15α-trihydroxy-entkaur-16-ene。

化合物3：白色粉末（甲醇）。10%硫酸-乙醇溶液加熱不顯色，碘顯色呈黃棕色。EI-MSm／z：305 ［M+H］+，結合碳譜數據，推測其分子式C20H32O2，不飽和度 5。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.11（1H，s，H-15），3.83（1H，m，H-6），2.32（1H，dd，J=11.7，3.6 Hz，H-1a），2.11（1H，dd，J=12.1，4.0 Hz，H-14），2.04（1H，d，J=10.1 Hz，H-7），1.72（1H，m，H-9），1.68（1H，d，J=1.2 Hz，H-17），1.60（3H，brs，CH3-18），1.52（2H，m，H-11），1.47（2H，m，H-12），1.44（1H，m，H-13），1.21（3H，s，CH3-19），1.12（3H，s，CH3-20），1.11（1H，s，H-9），1.08（1H，d，J=10.5 Hz，H-5），0.94（1H，t，J=11.7 Hz，H-1b）；13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：50.3（C-1），65.1（C-2），54.1（C-3），36.6（C-4），61.4（C-5），68.1（C-6），45.6（C-7），50.1（C-8），49.5（C-9），43.9（C-10），19.9（C-11），26.1（C-12），45.6（C-13），50.9（C-14），136.3（C-15），143.9（C-16），15.4（C-17），37.5（C-18），23.1（C-19），20.1（C-20）。以上數據與文獻［10］基本一致，故鑒定為multikaurane A。

化合物4：白色粉末（甲醇）。10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。EI-MSm／z：304［M］+，結合碳譜數據，推測其分子式C20H32O2，不飽和度5。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.96～5.38（1H，dd，J=15.0 Hz，H-17），3.92（1H，m，H-2），2.75（1H，m，H-12），1.95（1H，m，H-14），1.12（1H，m，H-9），0.99（3H，s，CH3-18），0.93（3H，s，CH3-19）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：50.4（C-1），65.5（C-2），51.8（C-3），42.4（C-4），57.0（C-5），20.3（C-6），19.3（C-7），48.9（C-8），55.9（C-9），35.6（C-10），36.5（C-11），43.7（C-12），33.9（C-13），37.4（C-14），83.8（C-15），160.4（C-16），109.1（C-17），34.3（C-18），22.9（C-19），19.4（C-20）。以上數據與文獻［13］基本一致，故鑒定為2β，15α-diol-ent-kaur-16-ene。

化合物5：白色針晶（氯仿）。10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。EI-MSm／z：442［M］+，結合碳譜數據，推測其分子式C30H50O2，不飽和度6。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.33（1H，d，J=4.0 Hz，H-19a），0.55（1H，d，J=4.0 Hz，H-19b），0.81（3H，s，H-30），0.89（6H，d，J=7.0 Hz，CH3-21，28），0.97（6H，s，CH3-18，29），1.73（3H，s，CH3-27），3.28（1H，m，H-3），4.02（1H，t，J=6.5 Hz，H-24），4.84（2H，s，H-26）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：30.4（C-1），29.9（C-2），78.8（C-3），40.5（C-4），47.1（C-5），21.1（C-6），28.1（C-7），48.0（C-8），20.0（C-9），26.0（C-10），26.0（C-11），35.9（C-12），45.2（C-13），48.8（C-14），32.8（C-15），26.4（C-16），52.1（C-17），18.0（C-18），28.1（C-19），35.5 和35.9（C-20），18.3（C-21），31.9 和31.9（C-22），31.6 和31.4（C-23），76.4（C-24），147.4 和 147.7（C-25），110.9 和111.4（C-26），17.2 和17.6（C-27），19.3（C-28），25.4（C-29），14.0（C-30）。以上數據與文獻［18］基本一致，故鑒定為cycloart-25-en-3β，24-diol。

化合物6：淡黃色固體（甲醇），Libermann-Burchard 反應呈陽性，10% 硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。EI-MSm／z：429 ［M+H］+，結合碳譜數據，推測其分子式C28H44O3，不飽和度7。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.51（2H，d，J=8.7 Hz，H-7），6.25（2H，d，J=8.7 Hz，H-6），5.16（1H，m，H-22），5.22（3H，m，H-23），3.97（1H，m，H-3），1.09（3H，s，CH3-21），0.92（3H，d，J=7.6 Hz，H-28），0.89（3H，s，CH3-19），0.82（3H，s，CH3-18），0.81（3H，d，J=7.6 Hz，H-26）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：34.8（C-1），30.2（C-2），66.6（C-3），37.0（C-4），82.3（C-5），135.5（C-6），130.9（C-7），79.6（C-8），51.1（C-9），37.0（C-10），23.5（C-11），39.4（C-12），44.7（C-13），51.8（C-14），20.8（C-15），28.8（C-16），56.2（C-17），13.0（C-18），18.3（C-19），39.9（C-20），21.0（C-21），135.3（C-22），132.4（C-23），42.9（C-24），33.2（C-25），19.8（C-26），20.1（C-27），17.7（C-28）。以上數據與文獻［19］基本一致。故鑒定為（22E）-5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3β-ol。

化合物7：白色針晶（氯仿），Libermann-Burchard 反應呈陽性，10%硫酸-乙醇溶液加熱顯紫紅色。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.37（1H，brd，J=4.9 Hz，H-6），3.53（1H，m，H-3），1.08（3H，s，CH3-19），0.96（3H，d，J=8.0 Hz，CH3-21），0.91（3H，s，J=8.0 Hz，CH3-29），0.86（3H，d，J=7.2 Hz，CH3-26），0.85（3H，d，J=7.2 Hz，CH3-27），0.67（3H，s，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：37.6（C-1），30.0（C-2），72.5（C-3），39.0（C-4），141.2（C-5），122.0（C-6），32.1（C-7），32.1（C-8），50.3（C-9），36.9（C-10），21.3（C-11），39.7（C-12），42.6（C-13），56.9（C-14），24.6（C-15），28.5（C-16），56.1（C-17），12.4（C-18），19.7（C-19），36.2（C-20），19.3（C-21），34.1（C-22），26.1（C-23），45.9（C-24），29.4（C-25），19.8（C-26），20.4（C-27），23.3（C-28），12.5（C-29）。以上數據與文獻［20］基本一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物8：白色油狀液體（氯仿）。10%硫酸-乙醇溶液加熱不顯色，用碘顯色為黃棕色。EI-MSm／z：185 ［M-H］-，結合碳譜數據，推測其分子式C12H26O，不 飽 和 度0。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.65（2H，t，J=6.6 Hz，H-1），1.58（2H，m，H-2），1.26（18H，s，H-3～H-11），0.88（3H，t，J=6.9 Hz，H-12）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：63.3（C-1），32.9（C-2），32.1（C-3），29.9（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.8（C-7），29.6（C-8），29.5（C-9），25.9（C-10），22.9（C-11），14.3（C-12）。以上數據與文獻［21］基本一致，故鑒定為正十二烷醇。

化合物9：白色結晶性蠟狀固體（氯仿），mp 54～55 ℃。10% 硫酸-乙醇溶液加熱不顯色，用碘顯色為黃棕色。EI-MSm／z：228［M］+，結合碳譜數據，推測其分子式C14H28O2，不飽和度1。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：2.32（2H，t，H-2），1.26（32H，m，H-3～H-13），0.88（3H，t，H-14）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：173.5（C-1），34.2（C-2），32.1（C-3），29.8（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.7（C-7），29.6（C-8），29.5（C-9），29.4（C-10），29.3（C-11），25.0（C-12），22.9（C-13），14.3（C-14）。以上數據與文獻［22］基本一致，故鑒定為正十四烷酸。

化合物10：白色粉末狀固體（氯仿），mp 63～64 ℃。10%硫酸-乙醇溶液加熱不顯色，用碘顯色為黃棕色。EI-MSm／z：257 ［M+H］+，結合碳譜數據，推測其分子式C16H32O2，不飽和度1。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.89（3H，t，J=6.7 Hz，CH3-16），1.64（26H，m，H-3～H-15），2.36（2H，t，J=7.5 Hz，H-2）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），32.0（C-3），29.8（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.8（C-7），29.8（C-8），29.7（C-9），29.5（C-10），29.5（C-11），29.4（C-12），29.2（C-13），24.8（C-14），22.8（C-15），14.1（C-16）。以上數據與文獻［23］基本一致，故鑒定為正十六烷酸。

化合物11：白色粉末（氯仿）。10% 硫酸-乙醇溶液加熱顯紅色。EI-MSm／z：297 ［M-H］-，結合碳譜數據，推測其分子式C19H38O2，不飽和度1。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.14（2H，m，H-18），2.33（2H，m，H-2），0.87（6H，t，J=6.9 Hz，CH3-17，CH3-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：174.1（C-1），34.2（C-2），25.0（C-3），29.2（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.8（C-7），29.8（C-8），29.8（C-9），29.6（C-10），29.5（C-11），29.5（C-12），29.4（C-13），29.3（C-14），32.1（C-15），22.8（C-16），14.3（C-17），65.2（C-18），14.3（C-19）。以上數據與文獻［24］基本一致，故鑒定為十七烷酸乙酯。

化合物12：白色片狀晶體，mp 68～71 ℃。10%硫酸-乙醇溶液加熱不顯色，用碘顯色為黃棕色。EI-MSm／z：284［M］+，結合碳譜數據，推測其分子式C18H36O2，不飽和度1。1H-NMR（400 MHz，C5d5N）δ：0.87（3H，t，J=5.64 Hz，CH3-18），1.30（28H，m，H-4～H-17），1.82（2H，m，H-3），2.53（2H，t，J=5.92 Hz，H-2）；13CNMR（100 MHz，C5d5N）δ：176.1（C-1），34.9（C-2），25.7（C-3），29.7、29.8、29.9、30.0、30.0 分別為C-4～C-15，32.2（C-16），23.0（C-17），14.3（C-18）。以上數據與文獻［25］基本一致，故鑒定為硬脂酸。