副溶血性弧菌耐藥基因的研究進(jìn)展

鄭 林祝令偉郭學(xué)軍?陳 萍

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2．軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所／吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130122）

自從1921年發(fā)現(xiàn)青霉素具有抗菌活性后［1］，從醫(yī)藥、農(nóng)牧業(yè)到水產(chǎn)業(yè)，人們對(duì)于抗生素的使用日漸增加。抗生素的大量使用挽救了無(wú)數(shù)生命，也促進(jìn)了農(nóng)牧業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)，但同時(shí)也造成了細(xì)菌耐藥性的廣泛流行。細(xì)菌獲得耐藥基因之后，還可通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等方式將耐藥基因傳遞到其他細(xì)菌中，甚至可以在不同種屬的細(xì)菌中傳播，使受體細(xì)菌獲得更多的耐藥性，從而增加了治療的難度。水環(huán)境是發(fā)生耐藥基因水平傳遞的最佳場(chǎng)所，副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水環(huán)境中的主要病原菌，于1950年在日本首次被發(fā)現(xiàn)［2］。該菌的O3K6 血清型曾引起1994年印度加爾各答和1998年美國(guó)兩次大規(guī)模食物中毒事件，最后通過(guò)使用抗生素控制了疫情［3-4］。據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心（CDC）報(bào)道，自2001年以來(lái)副溶血性弧菌感染的發(fā)生率又開(kāi)始顯著提升［5］。在美國(guó)，平均每年有215 人感染副溶血性弧菌，其中有30 人住院，1～2 人死亡［6］。用于治療副溶血性弧菌感染的推薦抗生素為四環(huán)素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)［7］，其中四環(huán)素或環(huán)丙沙星還可用于副溶血性弧菌的長(zhǎng)期治療［6］。大部分副溶血性弧菌對(duì)抗生素都比較敏感，但是，近幾年副溶血性弧菌對(duì)抗生素的抗性也逐年增加。本文就近幾年副溶血性弧菌對(duì)抗生素的耐藥現(xiàn)狀進(jìn)行對(duì)比分析，并對(duì)其耐藥機(jī)制和耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 副溶血性弧菌耐藥性的現(xiàn)狀

1．1 美洲 通過(guò)對(duì)2005年到2014年美國(guó)的水環(huán)境、路易斯安那海灣的零售牡蠣和墨西哥加利福尼亞州的海龜樣品進(jìn)行副溶血性弧菌分離和耐藥數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌對(duì)氨芐西林具有嚴(yán)重的抗性。對(duì)比2005年在水環(huán)境分離的菌株與零售牡蠣中分離的菌株的耐藥數(shù)據(jù)，零售牡蠣中分離得到具有氨芐西林抗性的菌株分離率為57%，略高于水環(huán)境中分離得到的氨芐西林抗性菌株，但是在零售牡蠣中未分離出具有多重耐藥的菌株；在墨西哥海龜中分離的菌株與美國(guó)水環(huán)境中分離的菌株的耐藥率并無(wú)太大差別，都僅表現(xiàn)出對(duì)氨芐西林的抗性，對(duì)于其他的抗生素僅表現(xiàn)出較低的抗性。到目前為止，在美洲分離的副溶血性弧菌對(duì)于青霉素類(lèi)藥物具有嚴(yán)重的抗性，對(duì)于其他類(lèi)型的抗生素自2012年以后都得到了很好的控制［8-11］。

1．2 歐洲 分析2001年到2013年分別對(duì)亞得里亞海魚(yú)場(chǎng)、貝類(lèi)、臨床樣品、新鮮及冷凍的海產(chǎn)品和英國(guó)的林肯郡的貝類(lèi)中分離得到的副溶血性弧菌耐藥數(shù)據(jù)、并與美洲的耐藥數(shù)據(jù)對(duì)比，二者相同的是大部分副溶血性弧菌都表現(xiàn)出嚴(yán)重的氨芐西林抗性，但在英國(guó)的林肯郡的貝類(lèi)中分離得到的副溶血性弧菌的氨芐西林耐藥率僅為1．3%，這與美洲和意大利中分離的具有氨芐西林抗性的菌株的結(jié)果出入較大。歐洲分離的副溶血性弧菌的耐藥率整體而言比美洲的要高，直到2013年，副溶血性弧菌的耐藥得到了一定的控制，但是仍然對(duì)一些弧菌屬推薦的抗生素（如氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑）具有一定的耐藥性［12-14］。

1．3 亞洲 2002年到2016年對(duì)我國(guó)東南沿海地區(qū)（包括上海市、深圳市、江蘇省、浙江省等地）中分離的77 株O3K6 血清型副溶血性弧菌進(jìn)行耐藥鑒定，其中對(duì)氨芐西林、磺胺甲基異惡唑和鏈霉素的耐藥率最高，分別為84．42%、36．36%、32．47%，多重耐藥率高達(dá)14．29%。在韓國(guó)分離的副溶血性弧菌的多重耐藥率顯著高于中國(guó)，44 株中就有25 株為多重耐藥菌株，并且在2003年到2016年期間，韓國(guó)的副溶血性弧菌的耐藥率呈明顯的上升趨勢(shì)，多重耐藥率從2015年的56．8%上升到2016年的93．3%。在馬拉西亞的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌的耐藥情況也相當(dāng)?shù)膰?yán)重，2014年的時(shí)候幾乎所有的副溶血性弧菌都對(duì)氨芐西林、青霉素、甲氧西林和新生霉素耐藥，到了第二年，氨芐西林的耐藥率有所下降，但是頭孢類(lèi)及四環(huán)素的抗性卻增加，這些頭孢類(lèi)及四環(huán)素抗性的菌株多來(lái)自于貝類(lèi)［15-19］。

1．4 非洲 2012年和2016年對(duì)南非和尼日利亞中分離得到的副溶血性弧菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2016年在尼日利亞分離得到的菌株的耐藥率遠(yuǎn)高于2012年在南非分離得到的菌株的耐藥率，其中2016年的分離的菌株的多重耐藥率高達(dá)67．6%，而2012年分離的菌株則僅表現(xiàn)出對(duì)青霉素、甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑和頭孢噻吩具有較強(qiáng)的抗性［20-21］。

2 副溶血性弧菌的耐藥機(jī)制

細(xì)菌對(duì)于外界不良環(huán)境（如危害其生存的抗生素）有很強(qiáng)的適應(yīng)性。從進(jìn)化的角度來(lái)看，細(xì)菌可采用多種方式來(lái)應(yīng)對(duì)抗生素的殺傷作用。主要包括與藥物作用機(jī)制相關(guān)的基因突變、激活外排機(jī)制來(lái)排出藥物、產(chǎn)生水解抗生素的酶類(lèi)［22］以及通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移（HGT）獲得編碼外源耐藥基因［22］等。

2．1 副溶血性弧菌靶位基因的改變 細(xì)菌通過(guò)基因突變產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要是通過(guò)對(duì)抗生素作用靶位的改變來(lái)降低對(duì)藥物的親和力，從而導(dǎo)致藥物效果減低；也有通過(guò)突變減少細(xì)胞壁上的受體從而導(dǎo)致減少藥物的攝取達(dá)到耐藥。例如，喹諾酮類(lèi)藥物的作用靶位是DNA 促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，它通過(guò)干擾DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能以達(dá)到殺菌作用［23］?；【鷮偌?xì)菌可以通過(guò)gyrA突變和parC突變達(dá)到抵抗作用。gyrA基因的第83 位氨基酸ser突變?yōu)閘le 或parC基因的第85 位氨基酸ser 突變?yōu)閜he 均可導(dǎo)致副溶血性弧菌獲得喹諾酮抗性［24-26］；副溶血性弧菌編碼外膜蛋白（OMP）的vpa0116 基因也同樣與喹諾酮抗性有關(guān)，具有vpa0116 基因的副溶血性弧菌在Na+濃度增加時(shí)會(huì)對(duì)慶大霉素的耐藥性有所提高［27］。在肺炎克雷伯中發(fā)現(xiàn)，qnrA基因與喹諾酮的多重耐藥有關(guān)，Saga T 等在副溶血性弧菌中發(fā)現(xiàn)VPA0095 基因與qnrA基因互為同源染色體，具有該基因的副溶血性弧菌同樣可以對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物產(chǎn)生抗性［28］。

2．2 副溶血性弧菌的外排膜泵 細(xì)菌對(duì)抗生素的外排系統(tǒng)包括四類(lèi)：主要協(xié)助蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)超家族（MFS）、小多耐藥蛋白超家族（SMR）、耐藥結(jié)節(jié)分化超家族（RND）、ATP 結(jié)合盒超家族（ABC）［29］。副溶血性弧菌中的RND 家族與副溶血性弧菌的外膜蛋白VPoC 協(xié)同作用可產(chǎn)生耐藥性［30］。在副溶血性弧菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的外排膜泵家族MATE 家族，其中的保守區(qū)域?yàn)锳sp32，Glu261 和Asp367，這些氨基酸殘基在某種程度上參與了轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［31］。MATE 家族中的NorM基因與大腸桿菌中的YdhE基因具有高度的同源性［29］。

2．3 副溶血性弧菌產(chǎn)生水解酶類(lèi) β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物可以通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁合成達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用，該藥物具有毒性低作用范圍廣等特點(diǎn)。細(xì)菌抵抗β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的主要機(jī)制之一是產(chǎn)生水解β-內(nèi)酰胺的β-內(nèi)酰胺水解酶［32］。弧菌屬細(xì)菌均存在VbrK／VbrR基因，該基因調(diào)控blaA 所編碼的β-內(nèi)酰胺酶與β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的抗性有關(guān)［33］。副溶血性弧菌對(duì)頭孢菌素產(chǎn)生抗性比較少見(jiàn)，β-內(nèi)酰胺酶中的blaPER-1基因、blaCMY-2基因和blaTEM基因與第三代和第四代頭孢菌素的抗性有關(guān)。副溶血性弧菌中的A 類(lèi)羧芐青霉素水解β-內(nèi)酰胺酶家族（CARB）blaCARB-17可產(chǎn)生對(duì)青霉素的固有耐藥，blaCARB-17家族中的blaV110基因同樣介導(dǎo)副溶血性弧菌的氨芐西林、哌拉西林和青霉素耐藥，該基因與假單胞菌屬中的PSE-4 基因具有高度同源性［34］。

2．4 副溶血性弧菌的耐藥基因水平傳遞 細(xì)菌主要以三種方式獲得外源遺傳物質(zhì)，分別為轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合，在細(xì)菌內(nèi)部可通過(guò)整合子將多種耐藥基因重組成為多重耐藥菌，而整合子還可以以移動(dòng)的基因盒的形式將新基因重組到細(xì)菌染色體或質(zhì)粒等遺傳物質(zhì)中［22，35］。

2．4．1 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是指受體菌細(xì)胞從環(huán)境中吸收裸露的外源DNA，從而獲得外源DNA 所攜帶的遺傳信息。在自然環(huán)境中只有那些處于感受態(tài)的細(xì)胞才能獲得外源DNA，該水平轉(zhuǎn)移方式在自然界中比較少見(jiàn)［22］。但是，最近有研究表明副溶血性弧菌的胞外DNA 可以通過(guò)特殊的生物膜而進(jìn)行傳遞形成群體耐藥［36-38］。

2．4．2 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)是指噬菌體通過(guò)尾軸將DNA 注入細(xì)菌中并進(jìn)行復(fù)制，在復(fù)制過(guò)程中與細(xì)菌中的某些DNA 片段整合，然后噬菌體便可以攜帶細(xì)菌的DNA 片段進(jìn)行再裝配，當(dāng)該噬菌體感染其他細(xì)菌時(shí)，便將自身攜帶的供體菌DNA 片段轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)［22］。目前發(fā)現(xiàn)的副溶血性弧菌噬菌體只有vf12 和vf33 兩種絲狀噬菌體。對(duì)Vf12 和Vf33 基因組潛在的11 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）和4 個(gè)未知的基因區(qū)間（IG） 的進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了8 個(gè)ORFs（vpf243，vpf402，vpf117，vpf81，vpf77，vpf491，vpf104和vpf380）在一個(gè)方向上轉(zhuǎn)錄，3 個(gè)ORFs（vpf261，vpf122 和vpf152）轉(zhuǎn)錄的方向與其相反。其中七個(gè)ORFs 和一個(gè)IG（vpf402，vpf117，vpf81，vpf77，IG3，vpf491，vpf104 和vpf380）的組成及氨基酸數(shù)量與霍亂弧菌的CTX 噬菌體中的6 個(gè)基因和一個(gè)IG 區(qū)間極為相似（rstA，rstB，cep，orfU，ace，zot 和IG）。雖然vf12 和vf33 具有攜帶耐藥基因的能力，但目前僅發(fā)現(xiàn)它們與副溶血性弧菌的毒力有關(guān)，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移［39］。

2．4．3 接合 接合是指供體菌和受體菌之間的通過(guò)性菌毛進(jìn)行的遺傳物質(zhì)傳遞，它可以介導(dǎo)同種屬或不同種屬之間進(jìn)行遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移。攜帶耐藥基因的質(zhì)粒、整合子和整合元件等可通過(guò)接合轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)不同細(xì)菌間的耐藥基因的交換和進(jìn)化［22］。

2015年首次在副溶血性弧菌中的IncA／C 型接合質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了blaCMY-2基因，進(jìn)而確定了該基因可以進(jìn)行細(xì)菌間的水平傳播［40］。另外，在副溶血性弧菌中發(fā)現(xiàn)了攜帶編碼PER-1 基因的IncN質(zhì)粒，該基因?yàn)槌瑥V譜β-內(nèi)酰胺酶基因，但PER-1在質(zhì)粒上的遺傳機(jī)制尚不清楚［38］。也有實(shí)驗(yàn)證明將抗諾氟沙星的副溶血性弧菌的pmvP36 質(zhì)粒中的NorM基因?qū)氪竽c桿菌中，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)諾氟沙星，環(huán)丙沙星，卡那霉素，鏈霉素的抗性有所提升［41］。

目前在副溶血性弧菌中僅發(fā)現(xiàn)了1 型整合子。在副溶血性弧菌1 型整合子中已經(jīng)確定了的基因盒有aadA1，dfrA1 和aacA3［42］。對(duì)β-內(nèi)酰胺具有抗性的副溶血性弧菌中含有blaVEB的整合子，該整合子發(fā)現(xiàn)具有多重耐藥區(qū)域（MDR）與qnrVC4 基因盒［43］。

1991年在南非的環(huán)境菌株中首次發(fā)現(xiàn)了ICE／R391家族整合性結(jié)合元件（integrative and conjugative element，ICE VpaChn1）［44-45］。將該整合元件敲除后，可導(dǎo)致敲除菌株對(duì)鏈霉素，新諾明等抗生素的抗性下降［46-47］，證明ICE 能夠攜帶耐藥基因并賦予臨床和環(huán)境菌株的耐藥性。它們存在于細(xì)菌染色體中，并且可以通過(guò)綴合再次切除，轉(zhuǎn)移并整合到相容的新宿主染色體中。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多不同的ICE，SXT／R391 家族是弧菌屬中最常見(jiàn)的，該整合元件在耐新諾明的副溶血性弧菌中被發(fā)現(xiàn)［48］。具有SXT／R391 的副溶血性弧菌對(duì)重金屬鎘、銅、鋅和汞同樣具有高度耐受性［49］。

3 展 望

美洲與歐洲的耐藥率相對(duì)于亞洲和非洲比較呈現(xiàn)相對(duì)較低的狀態(tài)，幾乎所有國(guó)家分離得到的菌株都對(duì)氨芐西林耐藥，在水產(chǎn)品中分離獲得的副溶血性弧菌較水環(huán)境中分離得到的副溶血性弧菌耐藥率較高，并且多重耐藥菌株幾乎均來(lái)自于水產(chǎn)品中（如牡蠣、貝類(lèi)等），副溶血性弧菌對(duì)于弧菌屬的推薦使用藥物均有不同程度的抗性。

目前來(lái)看，副溶血性弧菌的耐藥現(xiàn)狀并不是很?chē)?yán)重，但我們不能因此就掉以輕心，對(duì)于它的耐藥機(jī)制和水平轉(zhuǎn)移還有很多盲區(qū)。雖然目前還在使用抗生素治療副溶血性弧菌感染，但由于副溶血性弧菌對(duì)弧菌屬推薦使用的抗生素目前都呈現(xiàn)出不同程度的抗性，尤其對(duì)氨芐西林的抗性較高，近幾年人們開(kāi)始探索一些新的方法來(lái)進(jìn)行抗生素的替代，例如在水中加入噬菌體、蛭弧菌、光合細(xì)菌或者其他益生菌，來(lái)進(jìn)行環(huán)境副溶血性弧菌的消除，也可以對(duì)水生生物進(jìn)行免疫激活劑的使用來(lái)提高它們自身的免疫力［50-51］。