RNA結(jié)合基序蛋白20在心肌病中作用的研究進(jìn)展

楊 珍，劉宇寧，余 薇,鄭 萍

(湖北科技學(xué)院1.藥學(xué)院、2.臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

近年來，由于人口的增長和老齡化，心臟疾病的發(fā)病率不斷升高，防治心臟疾病已經(jīng)成為國家社會(huì)共同面對(duì)的巨大問題。全球每年死于心臟疾病人數(shù)約350萬人。心臟疾病是美國的十大死因之首[1]。心肌病是心臟疾病的一種，給社會(huì)和個(gè)人帶來了極大的健康威脅和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，尋找防治心肌病治療的靶點(diǎn)和途徑刻不容緩?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)很多因素參與心肌病發(fā)生、發(fā)展，目前認(rèn)為RNA結(jié)合基序蛋白20(RNA-binding motif protein 20，RBM 20)與心肌病密切相連。本文主要圍繞近年來RBM 20調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)行綜述。

1 RBM 20的結(jié)構(gòu)與功能

RBM 20由14個(gè)外顯子組成，編碼具有原型RNA識(shí)別基序1(RRM-1)的RNA結(jié)合基序蛋白20，在橫紋肌尤其是心肌中高度表達(dá)[2]。RBM 20蛋白含有其他剪接因子常見的典型結(jié)構(gòu)域，包括富含脯氨酸、谷氨酸的結(jié)構(gòu)域，原型核糖核酸識(shí)別基序(prototypical ribonucleic acid recognition motif，RRM)，富含精氨酸/絲氨酸的結(jié)構(gòu)域(arginine/serine-rich domain，RS)和U1鋅指結(jié)構(gòu)域。其中，RRM和RS是兩個(gè)高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，對(duì)于蛋白質(zhì)的核保留是必需的[3]。日益認(rèn)為RBM 20結(jié)構(gòu)的變化與心臟疾病密切相關(guān)。RBM 20中鑒定出第1個(gè)突變涉及肌聯(lián)蛋白(Titin)的選擇性剪接。近幾年，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種基因突變，突變熱點(diǎn)發(fā)生在RRM和RS結(jié)構(gòu)域：V535I、R634Q、R634W、S635A、R636C、R636H、R636S、S637G、P638L，以及突變熱點(diǎn)外的富含谷氨酸結(jié)構(gòu)域：E913K以及位于外顯子9的R716Q。RBM 20突變可能導(dǎo)致RBM 20蛋白錯(cuò)誤折疊，并干擾其與目標(biāo)RNA序列結(jié)合的能力，也可能干擾RBM 20的核定位[4-5]。

選擇性剪接在心臟適應(yīng)性反應(yīng)中起主要作用，剪接因子序列的改變或突變導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的錯(cuò)誤剪接，是多種人類遺傳疾病的根本原因。研究表明，RBM 20對(duì)RNA剪接體的形成和選擇性剪接起調(diào)控作用。剪接體是在剪接過程中從轉(zhuǎn)錄前體信使RNA(RNA precursors，pre-mRNAs)中去除內(nèi)含子的核糖核蛋白復(fù)合物。RBM 20直接調(diào)節(jié)心臟依賴的RNA加工轉(zhuǎn)錄因子，影響下游基因的表達(dá)模式，從而導(dǎo)致心臟疾病[6]。RNA測(cè)序表明，RBM 20選擇性剪接與心肌病、離子穩(wěn)態(tài)和肌節(jié)生物學(xué)密切相關(guān)的31個(gè)基因具有關(guān)聯(lián)性。最近的一項(xiàng)研究表明，在大鼠心臟組織中，有18個(gè)基因直接與RBM 20結(jié)合，并受RBM 20選擇性剪接，在這些基因中，RBM 20對(duì)Titin、鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)激酶IIδ(Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱδ，CaMKⅡδ)、鈣離子通道基因CACNA1C、橫紋肌LIM域結(jié)合蛋白3(LIM-domain-binding protein 3，LDB 3)、阿諾堿受體2(ryanodine receptor 2，RyR 2)進(jìn)行保守的差異剪接[7]。RBM 20的選擇性剪接功能與心肌病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

2 RBM 20與心肌病

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一種以左心室擴(kuò)大和收縮功能降低為特征的常見病癥，具有高滲透性、侵襲性，不可避免地導(dǎo)致心力衰竭。2009年，人們首次發(fā)現(xiàn)，家族性DCM患者的RBM 20 RS結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，因?yàn)镽BM 20在心肌中高度表達(dá)，并且編碼調(diào)控前信使RNA的剪接體，因此認(rèn)為其與人類心肌病密切相關(guān)[8]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，RBM 20是DCM中突變頻率最高的基因之一，RBM 20突變會(huì)導(dǎo)致DCM、進(jìn)行性心力衰竭和猝死，在高達(dá)3%的特發(fā)性DCM患者、5%的確診或疑似家族性病例和超過13%的有心源性猝死病史的患者中，都發(fā)現(xiàn)了RBM 20突變。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，RBM 20基因敲除的大鼠和具有RBM 20突變的人都患有心肌纖維化、心律失常和猝死，這說明RBM 20參與DCM的發(fā)生過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，RBM 20敲除會(huì)導(dǎo)致DCM?；蚯贸笫笊肀憩F(xiàn)為最大心輸出量降低，骨骼肌功能下降，左心室電鏡觀察到肌原纖維排列異常，脂褐素沉積[9]。此外，細(xì)胞水平上也驗(yàn)證了RBM 20的功能。在RBM 20敲除的小鼠的心肌細(xì)胞中，RBM 20突變會(huì)導(dǎo)致Titin向更有彈性的亞型轉(zhuǎn)變，RBM 20缺陷導(dǎo)致肌節(jié)組織紊亂和肌漿網(wǎng)中離子轉(zhuǎn)運(yùn)受損，最終導(dǎo)致DCM。多能干細(xì)胞中的RBM 20突變或RBM 20敲除重現(xiàn)了DCM患者的分子缺陷，與健康組相比，RBM 20突變多能干細(xì)胞組表現(xiàn)出α-輔肌動(dòng)蛋白的異常分布、鈣處理紊亂以及N2B亞型的表達(dá)水平降低[10-11]。

心肌病的終末階段會(huì)發(fā)生心力衰竭，射血分?jǐn)?shù)保留型心衰(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF)是一種以心室充盈功能受損為特征的復(fù)雜臨床綜合征，左心室僵硬度增加是HFpEF的重要特征。左心室僵硬程度由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和心肌細(xì)胞調(diào)節(jié)，而Titin調(diào)控ECM和心肌細(xì)胞的被動(dòng)剛度。實(shí)驗(yàn)表明，通過調(diào)節(jié)RBM 20表達(dá)水平來調(diào)節(jié)Titin剪接，有利于心臟在心衰時(shí)保持射血分?jǐn)?shù)。在Titin N2B亞型敲除小鼠中，RBM 20活性降低了50%，維持了心臟充盈舒張，改善了心臟萎縮，一定程度上恢復(fù)了與脂肪酸代謝以及橫紋肌發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)[12]。在RBM 20等位基因RRM敲除的小鼠模型心臟中，順應(yīng)性的Titin亞型大量表達(dá)，于3周時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量，舒張功能改善，最終導(dǎo)致左室順應(yīng)性增加，改善了左心室僵硬程度[13]。

3 RBM 20作用的調(diào)控機(jī)制

3.1 RBM 20與Titin肌節(jié)是橫紋肌肌原纖維中最小的收縮單元，Titin是肌節(jié)中的第3類豐富蛋白，決定了橫紋肌的結(jié)構(gòu)和彈性，與人類心臟病密切相關(guān)。Titin可在橫紋肌中產(chǎn)生數(shù)百萬種亞型，心臟Titin主要產(chǎn)生兩種主要亞型：短而僵硬的N2B亞型，以及更長、更有彈性的N2BA亞型[14]。根據(jù)發(fā)育階段和物種的不同，這兩種亞型之間的轉(zhuǎn)換提供可變的被動(dòng)剛度，以滿足生理需求。心肌被動(dòng)剛度的增加，可以防止舒張期間壓力增加而導(dǎo)致的心室過度充盈。研究發(fā)現(xiàn)，Titin亞型的轉(zhuǎn)變與心肌順應(yīng)性的變化、心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在一些心臟疾病中，Titin亞型比值發(fā)生變化。在健康人的左心室中，N2BA與N2B亞型的表達(dá)比約為30 ∶70，在收縮性心力衰竭的心臟中發(fā)現(xiàn)N2BA與N2B的比例增加，而舒張性心力衰竭N2BA與N2B比例下降。在RBM 20缺失的大小鼠模型中，N2BA/N2B發(fā)生變化，并且開始轉(zhuǎn)換以更大分子質(zhì)量的N2BA-G亞型存在，這說明RBM 20抑制Titin選擇性剪接[6]。

RBM 20通過調(diào)控Titin pre-mRNA的剪接，抑制Titin的表達(dá)。RBM 20與Titin pre-mRNA中含有UCUU的RNA元件結(jié)合，并抑制結(jié)合區(qū)域中內(nèi)含子的去除，除RNA元件的剩余pre-mRNA將被剪接并保留在細(xì)胞核中，等待進(jìn)一步處理[7]。在人和大鼠中，Titin的錯(cuò)誤剪接廣泛存在，RBM 20缺乏時(shí)Titin表達(dá)增多。

RBM 20介導(dǎo)的Titin剪接是劑量依賴性的。在野生型大鼠心肌中，主要表達(dá)較小的N2B亞型；在RBM 20敲除雜合大鼠中，高表達(dá)中等大小的N2BA；在RBM 20敲除純合大鼠中，表達(dá)大亞型N2BA-G。此外，研究表明，胰島素和甲狀腺激素可以通過激活磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of repamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路，增加RBM 20表達(dá)，進(jìn)而Titin亞型發(fā)生改變，降低了N2BA/N2B的比值；相反，抑制PI3K或mTOR激酶，可明顯降低剪接因子RBM 20的蛋白表達(dá)[15-16]。

有趣的是，RBM 20在由Titin基因形成的環(huán)狀RNA(Circular RNA，CircRNA)的過程中起著重要作用。CircRNA是一種非編碼RNA分子，心臟中約26%與外顯子跳躍有關(guān)的CircRNA來源于Titin，Titin通過選擇性剪接產(chǎn)生CircRNA。研究表明，在RBM 20敲除心臟中，有38個(gè)差異表達(dá)的CircRNA，其中12個(gè)來自Titin基因。這說明RBM 20參與Titin基因形成的CircRNA，但是現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)表明，RBM 20并不是心臟CircRNA形成的整體調(diào)節(jié)因子。目前關(guān)于CircRNA的研究尚少，還需進(jìn)一步探索[17]。

3.2 RBM 20與RyR 2阿諾堿受體參與心臟興奮-收縮偶聯(lián)的過程，是重要的Ca2+釋放通道，發(fā)揮維持細(xì)胞的興奮性的重要作用。RyR 2亞型主要在心肌和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。 RyR 2由4個(gè)單體組成，每個(gè)單體結(jié)合1個(gè)調(diào)節(jié)蛋白FK 506結(jié)合蛋白12.6 (FK 506 binding protein 12.6，F(xiàn)KBP 12.6)，F(xiàn)KBP 12.6和RyR 2結(jié)合，調(diào)節(jié)Ca2+釋放通道的開放[18]。

心肌RyR 2的激活和失活受鈣調(diào)素(calmodulin，CAM)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、CAMKII調(diào)節(jié)，同時(shí)FKBP 12、FKBP 12.6等也參與RyR2的調(diào)控。在CAM存在下，Ca2+激活PKA后，PKA磷酸化RyR 2，磷酸化的RyR 2與調(diào)節(jié)蛋白FKBP 12.6解離，鈣離子通道開放；RyR 2的磷酸被磷酸酶水解下來，使RyR 2重新與FKBP 12.6結(jié)合，此時(shí)通道關(guān)閉。RyR 2的磷酸化程度決定RyR 2的功能狀態(tài)，RyR 2的活性調(diào)節(jié)需要適當(dāng)?shù)牧姿峄?，但是過度的磷酸化會(huì)影響通道的正常功能。在心力衰竭的過程中，RyR 2的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了改變，影響了心臟的舒縮功能[7,19]。有研究結(jié)果表明，在RBM 20敲除大鼠和RBM 20突變?nèi)酥?，RyR 2中1個(gè)24 bp外顯子表達(dá)升高，這說明RyR 2的24 bp外顯子受RBM 20表達(dá)量高低的調(diào)節(jié)。也有初步研究表明，RBM 20突變的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞中，RyR 2表達(dá)升高[6]。RyR 2的突變與心律失常性右室心動(dòng)過速和猝死有關(guān)，心律失常和猝死都是RBM 20相關(guān)DCM的表征。最近的研究表明，RyR 2功能缺陷不僅與心律失常有關(guān)，還與心肌病有關(guān)。但是RBM 20調(diào)節(jié)RyR 2的機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。

3.3 RBM 20與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長、增殖、分化等多種活動(dòng)。生長因子激活PI3K，然后質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3促使Akt活化。活化的Akt磷酸化激活下游靶蛋白mTOR，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的生命活動(dòng)[20]。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與心肌病。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，可以減少心肌細(xì)胞凋亡程度，對(duì)缺血/再灌注損傷大鼠心肌具有保護(hù)作用；PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活調(diào)節(jié)下游靶的表達(dá)，減少急性心肌梗死的損傷；在心肌肥大動(dòng)物模型中，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活；PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活參與心肌細(xì)胞過氧化損傷過程。

外部刺激導(dǎo)致的錯(cuò)誤剪接可能改變N2B和N2BA的比值，從而損害心臟收縮功能。實(shí)驗(yàn)表明，RBM 20是胰島素激活的PI3K/Akt信號(hào)通路的下游底物，RBM 20是該通路下游連接胰島素與Titin剪接的重要蛋白。細(xì)胞水平上，胰島素或甲狀腺激素通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，增加RBM 20表達(dá)，進(jìn)而增加N2B亞型的表達(dá)，而RBM 20敲除后，外部刺激不會(huì)改變N2B的表達(dá)；在細(xì)胞和糖尿病動(dòng)物水平上，PI3K或mTOR激酶的抑制明顯降低了剪接因子RBM 20的蛋白質(zhì)水平[15]，觀察到N2B亞型表達(dá)減少，而RBM20敲除后，未觀察到N2B亞型表達(dá)的變化。RBM20與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的研究較少，仍需進(jìn)一步探索。

3.4 RBM 20與LDB 3/CaMKIIδ/CACNA1CLDB 3又稱Cypher基因，其編碼蛋白Cypher主要在橫紋肌中表達(dá)，位于肌小節(jié)的Z線上。LDB 3在收縮的機(jī)械應(yīng)力下，保持著Z線的結(jié)構(gòu)完整性，在肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能上起著重要作用[21]。對(duì)于LDB 3，外顯子4與外顯子5、6互相排斥，RBM 20通過使外顯子4、5、6同時(shí)表達(dá)，而調(diào)控LDB 3的組織特異性剪接。缺乏RBM 20時(shí)，外顯子4不表達(dá)，而外顯子5和6表達(dá)。在RBM 20敲除大鼠和RBM 20突變的個(gè)體的左心室組織中，外顯子4的表達(dá)下調(diào)[22]。

CaMKⅡδ是參與心臟中鈣處理、基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的關(guān)鍵酶，是通過對(duì)其底物受磷蛋白(phospholamban，PLB)、RyR和L型Ca2+通道(L-type Ca2+channels，LTCC)的磷酸化，進(jìn)行興奮-收縮偶聯(lián)的調(diào)節(jié)劑。大多表現(xiàn)為4種亞型：δ-A、δ-B、δ-C、δ-9。健康成人心臟中，表達(dá)最多的亞型是δ-B和δ-C，但是RBM 20的缺失，誘導(dǎo)向更大的δ-A和δ-9亞型轉(zhuǎn)變。研究表明，RBM 20突變導(dǎo)致的CaMKⅡδ剪接受損是引起心肌病的重要原因之一。在體外，心臟發(fā)育期間敲除RBM 20，可檢測(cè)到RBM 20缺乏的心肌細(xì)胞在分化后表現(xiàn)出病理性CaMKⅡδ[23]。CaMKIIδ的異常剪接可以影響鈣穩(wěn)態(tài)，并增加RBM 20突變個(gè)體猝死的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，在RBM 20敲除小鼠心肌細(xì)胞中，CaMKIIδ剪接異常，Ca2+處理受到嚴(yán)重?cái)_亂，LTCC活性明顯升高，導(dǎo)致L型Ca2+電流增加，收縮期Ca2+增加，肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)Ca2+增加。LTCC是RBM 20敲除心肌細(xì)胞中Ca2+超載的潛在原因[24]，用LTCC拮抗劑維拉帕米阻斷L型Ca2+電流可完全抑制SR自發(fā)性Ca2+釋放，表明L型Ca2+電流密度升高可增加Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而導(dǎo)致RBM 20敲除細(xì)胞內(nèi)的SR Ca2+超載。

CACNA1C不同亞型的表達(dá)與心律失常有關(guān)。RBM 20突變引起CACNA1C改變，進(jìn)而影響鈣離子穩(wěn)態(tài)，增高RBM 20突變體猝死的風(fēng)險(xiǎn)[25]。

4 結(jié)語

隨著基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)剪接因子調(diào)控基因的表達(dá)。RBM 20參與心臟關(guān)鍵基因的剪接，與心肌病密切相關(guān)，RBM 20調(diào)控Titin亞型轉(zhuǎn)換，被認(rèn)為是導(dǎo)致心肌病的重要原因。但是由于RBM 20如何調(diào)節(jié)Titin剪接的機(jī)制尚不清楚，所以針對(duì)RBM 20治療心肌病的研究還處于理論階段。探尋是否有其他調(diào)節(jié)因子參與RBM 20調(diào)控Titin剪接過程，RBM 20與Titin pre-mRNA的結(jié)合位點(diǎn)，以及是否可以通過抑制RBM 20調(diào)節(jié)Titin亞型改善心肌損傷，都將成為治療心肌病的新靶點(diǎn)和新手段。RBM 20調(diào)控多種與心臟疾病密切相關(guān)的基因，但其機(jī)制未明，仍需進(jìn)一步探索。