microRNAs在骨折愈合過程中對(duì)成骨細(xì)胞的作用

李晨 王鐵軍 譚磊 谷峰 夏永寧 張西正 朱東

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，吉林 長春 130021)

老年人骨質(zhì)相對(duì)青壯年人更加脆弱，因而在摔傷或交通事故等意外傷害事件中老年人更易受到外力作用而造成骨折。隨著對(duì)microRNAs(miR)進(jìn)行的研究越來越深入，miR對(duì)細(xì)胞生長與分化的調(diào)控作用也越來越受關(guān)注。miR在骨代謝中所起到的作用是其中的一個(gè)熱點(diǎn)。

1 骨折的愈合

骨折的愈合是一個(gè)連續(xù)的過程，而且愈合過程非常復(fù)雜〔1〕，一般認(rèn)為骨折愈合包含三個(gè)階段：血腫炎癥機(jī)化期，原始骨痂形成期，骨板形成塑形期，但這三個(gè)階段之間的界限并不完全明確，而是互相包含，逐步推進(jìn)。在這個(gè)過程中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的協(xié)同作用非常重要，成骨細(xì)胞的主要作用是合成骨基質(zhì)，破骨細(xì)胞則是吸收骨基質(zhì)。這兩種細(xì)胞的相互作用，使骨的生成和吸收達(dá)到動(dòng)態(tài)的平衡，從而保證骨折朝著愈合方向進(jìn)展。國內(nèi)外大量研究表明多種miR在成骨細(xì)胞的分化及增殖中起到重要調(diào)控作用從而影響骨折的愈合。

2 miR的發(fā)現(xiàn)、生成及作用機(jī)制

miR是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類長度為20～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA。自miR于1993年由Lee等〔2〕發(fā)現(xiàn)以來，人們對(duì)miR進(jìn)行了深入的研究。發(fā)現(xiàn)miR于細(xì)胞內(nèi)起到了多種非常重要的調(diào)節(jié)作用。一方面，每一個(gè)miR有多個(gè)目標(biāo)基因，另一方面，幾個(gè)miR也能夠作用于同一個(gè)基因。據(jù)推測(cè)，miR調(diào)節(jié)著人類三分之一的基因。miR最早于細(xì)胞核內(nèi)開始產(chǎn)生，miR基因首先被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為初始miR(pri-miR),在細(xì)胞核中通過多蛋白復(fù)合物的加工以產(chǎn)生更短的pri-miR結(jié)構(gòu)。然后精確加工的pri-miR將通過Exportin 5(一種存在于細(xì)胞核中的miR運(yùn)輸?shù)鞍?輸出到細(xì)胞核外，并加載到含有核糖核酸酶Ⅲ酶Dicer蛋白，Argonaute蛋白和其他輔助細(xì)胞因子的另一臺(tái)加工機(jī)器上。Dicer將介導(dǎo)pri-miR的切割以形成更加成熟的miR，然后該miR將被Argonaute蛋白結(jié)合形成沉默復(fù)合體(RISC)，其能夠通過序列互補(bǔ)性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)到mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)的特定區(qū)域以調(diào)控特定的蛋白質(zhì)表達(dá)〔3〕。

3 部分與成骨細(xì)胞相關(guān)的miR在骨折愈合過程中的作用及機(jī)制

3.1miR-29與成骨細(xì)胞 Oskowitz等〔4〕研究表明，在人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)分化期間miR的檢測(cè)鑒定了19個(gè)在成骨分化期間上調(diào)的miR。miR-29家族在人類存在于1號(hào)染色體和7號(hào)染色體，主要包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。其中miR-29a位于7號(hào)染色體(7q32),miR-29b位于7q32和1號(hào)染色體(1q32),miR-29c位于1q32〔5〕。研究表明miR-29通過多個(gè)途徑影響成骨。miR-29a對(duì)于成骨細(xì)胞形成的影響是通過一個(gè)正反饋調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路來進(jìn)行的：一方面，經(jīng)典的Wnt通路可以刺激miR-29的表達(dá)，另外一方面，miR-29 作用于Wnt通路的抑制因子:Dickkopf相關(guān)蛋白(DKK)1、Kremen和Wnt拮抗因子分泌型Frizzled 相關(guān)蛋白(SFRP)2，從而進(jìn)一步促進(jìn)Wnt信號(hào)通路活性和成骨細(xì)胞分化〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-29b通過幾種途徑影響成骨細(xì)胞的分化。一方面，miR-29b通過結(jié)合其mRNA中的靶3′-UTR序列降低已知的成骨細(xì)胞分化抑制劑如組蛋白去乙?；?HDAC)4，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β3，激活素A受體(ACVR)2A，β-catenin相互作用蛋白(CTNNBIP)1和雙特異性蛋白磷酸酶(DUSP)2蛋白的表達(dá)來促進(jìn)成骨。另一方面，miR-29b減弱了編碼骨細(xì)胞外基質(zhì)必需蛋白的膠原基因的表達(dá)，從而促進(jìn)礦物沉積〔7〕。miR-29c通過靶向調(diào)節(jié)蓬亂蛋白(Dvl)2間接促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向成骨分化、礦化能力〔8〕。

3.2miR-138與成骨細(xì)胞 研究表明，miR-138通過影響在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化中起重要作用的黏著斑激酶，調(diào)節(jié)hMSC的成骨分化。miR-138在hMSC的成骨細(xì)胞分化期間下調(diào)。miR-138的過表達(dá)在體外可以降低hMSCs的成骨細(xì)胞分化，而抗miR-138對(duì)miR-138功能的抑制促進(jìn)了成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)、堿性磷酸酶(ALP)的活性和基質(zhì)的礦物質(zhì)化。此外，miR-138的過表達(dá)使體內(nèi)異位骨形成減少了85%，相反，當(dāng)miR-138被拮抗時(shí)，體內(nèi)骨形成增強(qiáng)了60%。以上研究可以說明，miR-138在成骨過程中起負(fù)性調(diào)節(jié)的作用〔9〕。

3.3miR通過作用于runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)2影響骨折愈合 RUNX2已經(jīng)被許多研究證明為成骨細(xì)胞分化所必需，并在成骨細(xì)胞分化中起重要的調(diào)控作用。其在成骨細(xì)胞的分化中受到許多上游miR調(diào)控的同時(shí)，又同時(shí)調(diào)控許多下游miR。構(gòu)成一個(gè)以RUNX2為核心的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明〔10～14〕，在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR-23a～27a、miR-204/211、miR-2861、miR-146a、miRNA-20b等都通過作用RUNX2從而參與細(xì)胞成骨及骨折愈合。

3.4其他與成骨細(xì)胞相關(guān)的miR 研究表明miR-335-5p通過下調(diào)DKK1激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)成骨分化〔15〕。有研究表明，miR-125b對(duì)于hBMSCs的成骨分化的調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)Osx表達(dá)來進(jìn)行的〔16〕。Li等〔17〕研究表明，通過在骨形蛋白態(tài)發(fā)生(BMP)2誘導(dǎo)的間充質(zhì)細(xì)胞的成骨過程中分析miR，25個(gè)響應(yīng)于BMP2顯著改變的miR中的22個(gè)被下調(diào)。其中miR-133和 miR-135在成骨分化過程中起到重要作用。王海鵬等〔18〕研究表明miR-30a-5p對(duì)于MSCs向成骨細(xì)胞的分化具有促進(jìn)作用。

Mizuno等〔19〕將外源miR-125b轉(zhuǎn)染進(jìn)了ST2細(xì)胞后，觀察到細(xì)胞增殖的抑制和成骨細(xì)胞分化的抑制。而當(dāng)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-125b抑制劑時(shí)，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)的ALP活性升高，由此說明了細(xì)胞的成骨分化能力得到了促進(jìn)。以此證明了miR-125b通過對(duì)細(xì)胞增殖的影響參與成骨細(xì)胞分化。Itoh等〔20〕的研究證明miR-141和miR-200a通過作用于Dlx5并調(diào)節(jié)Dlx5的表達(dá)參與前成骨細(xì)胞分化。

國內(nèi)有學(xué)者研究證明，miR-144能夠?qū)SCs的成骨分化產(chǎn)生抑制作用，相反的miR-451則對(duì)成骨分化過程有促進(jìn)作用〔21〕。Hu等〔22〕研究證明了miR-132-3p可降低Ep300蛋白表達(dá)抑制成骨細(xì)胞分化。Wei等〔23〕研究表明，在miR-654-5p過表達(dá)的hBMSCs中BMP2 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),并且miR-654-5p可通過與特定靶位點(diǎn)結(jié)合直接抑制BMP2的mRNA和蛋白表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化。Kureel等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p通過作用于BMP-7抑制成骨細(xì)胞分化。Guo等〔25〕研究表明miR-17-92a通過調(diào)節(jié)Bim在雌激素中的表達(dá)在成骨細(xì)胞抗凋亡過程中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)及展望

綜上，miR通過多個(gè)途徑對(duì)于成骨細(xì)胞的增殖及分化起重要的調(diào)控作用從而影響骨折愈合。對(duì)miR施加影響來促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及表達(dá)從而加速和促進(jìn)骨折的愈合將成為以后研究方向，從而為老年患者的骨折治療尋找一種新的方法。