基于PDX模型的胃癌轉移相關基因研究進展

王潔，趙菊梅，魏曉麗*，師長宏

(1. 延安大學醫(yī)學院，延安 716000； 2. 空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，西安 710032)

胃癌(gastric cancer, GC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管通過手術和化療有所改善，但晚期胃癌的預后仍然很差，5年生存率接近20%[1]。侵襲和轉移是該病致死的主要原因，并極大影響治療效果[2]。胃癌轉移是一個復雜的生物學過程，與基因表達密切相關。由于基于臨床腫瘤標本異種移植(patient derived xenograft，PDX)模型具有較好的異質(zhì)性，基本保持了原發(fā)性腫瘤的生物學特性，易于發(fā)生轉移，因此成為胃癌研究的首選模型[3]。本文就基于胃癌PDX模型開展的轉移基因篩選和治療靶點的鑒定進行綜述，以期為胃癌的轉移研究提供良好的動物模型。

1 建立胃癌PDX轉移模型

1.1 胃癌PDX模型的特點

大多數(shù)胃癌患者在就診時出現(xiàn)轉移，常轉移的部位是淋巴結，肺，肝和腹膜。成功建立真實模擬人胃癌組織細胞侵襲和轉移生物學行為特征的動物模型已成為胃癌研究的重要前提。與傳統(tǒng)的細胞系異種移植模型相比，將患者新鮮的胃癌手術標本移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立的PDGCX(patient-derived gastric cancer xenograft)模型，含有源自患者的間質(zhì)細胞和免疫細胞[4]，可以提供適合腫瘤生長的微環(huán)境，保持了原發(fā)腫瘤的生物學特征和異質(zhì)性，為建立胃癌轉移模型和篩選胃癌轉移基因提供了有力的工具[5]。Zhang等[6]建立了32例胃癌PDX模型，其組織學和遺傳學特征保持與原始腫瘤一致。Zhu等[7]首次使用胃鏡活檢建立胃癌PDX模型，確認了生物學特征與患者的一致性，并且遺傳特征在傳代過程中保持穩(wěn)定。

1.2 影響PDGCX模型建立的因素

PDGCX模型的移植受多種因素的影響，除了移植宿主免疫缺陷的程度，還包括手術時間、植入組織塊的大小和數(shù)量、植入的位置，患者性別，化療狀態(tài)和腫瘤選取的部位等，而原發(fā)腫瘤的特征(腫瘤的侵襲性、勞倫分類和組織中的腫瘤細胞比率)被認為是重要的因素。Choi等[8]從62例胃癌患者中成功建立15例PDGCX模型，其中腸型胃癌，植入組織中腫瘤細胞百分比，離體和整體手術時間的減少與移植成功率相關。此外，在一項研究中發(fā)現(xiàn)男性患者(P=0.016)或腸道亞型(P=0.030)的胃癌組織在小鼠中更容易生長。在彌漫型胃癌中，腫瘤細胞分散于間質(zhì)組織中，單位面積的腫瘤細胞數(shù)量較少，不利于腫瘤的成功植入[6]?？傊壳氨容^明確的影響胃癌PDX模型建立的因素可概括為腫瘤類型，侵襲性，離體和手術時間，植入腫瘤細胞的數(shù)量等。

1.3 建立PDGCX轉移模型的方法

腫瘤轉移的發(fā)生與腫瘤細胞的轉移潛能和生長的微環(huán)境密切相關[9]。常規(guī)建立PDGCX轉移模型的方法是裸鼠皮下移植。Li等[10]將胃癌患者的腫瘤組織皮下植入裸鼠的右側和左側腹股溝建立PDGCX轉移模型，移植瘤在傳代中保持相同的組織學特征，并且在食道，胃，脾，肝等部位觀察到轉移。但是，這些轉移性腫瘤未發(fā)現(xiàn)CK8/18，E-鈣粘蛋白，VCAM-1，ICAM-1等和轉移相關的黏附分子的表達，提示，皮下移植可能會導致部分表型的丟失。腎包膜移植因其血管豐富增加移植成功率，且利于轉移的發(fā)生[11]，是建立實驗性轉移模型常用的方法。研究表明，原位移植(patient-derived orthotopic xenograft，PDOX)比皮下移植更容易發(fā)生轉移[12]?？商峁┡c腫瘤發(fā)生相似的微環(huán)境[13]，準確、客觀地模擬人體腫瘤的體內(nèi)演進過程，利于轉移相關基因的表達，易形成與臨床腫瘤相似的轉移特征。例如，在一項臨床相關性研究中，36例胃癌移植模型中有20例植入裸鼠原位發(fā)生生長，其中5例患有臨床肝轉移，相應5例均在裸鼠中產(chǎn)生肝轉移。6例患者的腫瘤臨床腹膜受累，對應其中5例發(fā)生裸鼠腹膜轉移[14]。王潔等[15]將胃癌新鮮的手術標本移植到裸鼠皮下，建立胃癌PDX模型，進一步通過手術將皮下瘤組織原位移植到裸鼠胃部肌層，發(fā)生肺和肝的轉移。

1.4 PDGCX轉移模型的檢測

轉移模型的檢測方法包括組織學檢測，ALU-PCR(ALU-聚合酶鏈反應)，以及非侵入性成像。常用的組織學檢測轉移的方法是將腫瘤組織固定，石蠟包埋后進行HE染色和免疫組化[16]，該方法簡單易于操作，但是由于腫瘤細胞在組織器官內(nèi)隨機分布，假陰性率高。ALU-PCR可以從復雜來源樣品中特異擴增人基因組DNA，是一種在合理的時間內(nèi)精確測量大樣本中轉移的非常敏感的方法，可以在含有低濃度模板的樣品上完成，如石蠟包埋組織[17]。Schneider等[18]發(fā)現(xiàn)可以從相當于1×106個鼠細胞中檢測出一個人類腫瘤細胞。但是此種方法需要形成轉移灶后，提取相應的組織，屬于有創(chuàng)性檢查。非侵入性成像，如超聲檢查(US)、正電子發(fā)射斷層掃描(CT/PET)可以檢測成瘤率和腫瘤生長狀況，同樣容易產(chǎn)生較高的假陰性率，很難識別微小病變和微轉移灶，敏感性、準確性和特異性較低。最近新報道的七甲川菁(heptamethine cyanine)近紅外熒光染料，如IR-783可特異性識別胃癌細胞[19]，不需標記探針可直接用于腫瘤模型的活體成像，具有成像和靶分子的雙重功能。王潔等[15]使用腎包膜和原位移植建立了PDGCX轉移模型，通過近紅外熒光活體成像技術觀察到裸鼠肺和肝臟部位轉移信號，為胃癌PDX轉移模型早期的檢測和篩選提供了可靠的方法。

2 篩選胃癌轉移相關基因方法

隨著高通量測序和芯片技術的普及，越來越多的胃癌轉移相關基因被發(fā)現(xiàn)。目前，篩選轉移相關基因的主要方法是提取轉移瘤和原發(fā)瘤的DNA或RNA，進行癌癥基因組圖譜，微陣列技術和PCR芯片的分析。

2.1 癌癥基因組圖譜

癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)是通過應用基因組分析技術，特別是采用大規(guī)模的基因組測序，將人類全部癌癥的基因組變異圖譜繪制出來，篩選癌基因和抑癌基因，進行系統(tǒng)分析，了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，發(fā)展新的診斷和治療方法。Ye等[20]應用TCGA-胃腺癌(STAD)和NCBI GEO數(shù)據(jù)庫研究miR-7和NF-κB、RelA/p65的表達情況。數(shù)據(jù)表明，胃癌中miR-7的缺失促進了p65介導的NF-κB的異常激活，促進了胃癌的轉移，提示miR-7可能成為NF-κB介導的胃癌遠處轉移的新的預后生物標記物和潛在的治療靶點。Liu等[21]從TCGA中確定了長非編碼RNA00941(LINC00941)是一種潛在的診斷和預后的生物標記物，并發(fā)現(xiàn)LINC00941的表達與胃癌的深度和遠處轉移有關。然而，無論是 TCGA還是GEO數(shù)據(jù)庫提供的都是mRNA水平的數(shù)據(jù)，無法完全代表胃癌中的蛋白表達情況，并且缺少臨床及細胞、動物功能學實驗。

2.2 甲基化CPG島擴增微陣列(MCAM)

隨著高通量技術的發(fā)展，大量的DNA甲基化數(shù)據(jù)可用于癌癥的預測和生物標記物的識別[22]。胃癌患者抑癌基因的異常甲基化提示表觀遺傳改變，它往往發(fā)生在臨床癥狀出現(xiàn)之前。Li等[23]發(fā)現(xiàn)基因啟動子區(qū)CpG位點的高甲基化可能是腫瘤轉移標本中基因表達下調(diào)的原因之一，提示DNA甲基化改變可能是促進腫瘤轉移的一個重要因素。Liu等[24]在胃癌中進行MCAM全基因組DNA甲基化分析，證明GFRA1、SRF和ZNF382的甲基化狀態(tài)可作為預測胃癌轉移的潛在協(xié)同生物標記物。然而，DNA甲基化數(shù)據(jù)的固有缺點，是與大量探針相比，樣本數(shù)量有限，可能導致分類性能的下降，并增加過度擬合的風險[25]。

2.3 PCR Array

PCR-Array亦被稱為功能分類芯片或PCR列陣，它結合了實時定量PCR技術靈敏可靠的優(yōu)勢以及微陣列技術同時檢測多種基因表達量的優(yōu)勢，是分析信號通路或某生物學功能相關基因表達狀態(tài)的首選工具。有人在轉染miR-335的細胞上進行PCR-Array，發(fā)現(xiàn)參與轉移和腫瘤侵襲的62個基因中的19個(30.6%)顯示轉錄水平降低，網(wǎng)絡富集分析最終確定PLAUR和CDH11是參與轉移和腫瘤侵襲途徑的潛在靶點[26]。Miwa等[27]從轉移胃癌患者的手術切除標本中進行轉錄組分析，確定HOXC10是轉移性胃癌組織中表達最高的基因。進一步PCR陣列分析表明HOXC10的功能與腫瘤的發(fā)生、遷移和侵襲所需的惡性表型密切相關。王潔等[15]通過裸鼠原位移植建立胃癌轉移性PDX模型，PCR-Array分析肺部轉移瘤和原發(fā)瘤中轉移相關基因的表達，發(fā)現(xiàn)有三個基因表達與原發(fā)瘤相比顯著上調(diào)(P< 0.01)，涉及CXCL12，IGF1和MMP2。

3 鑒定胃癌潛在治療靶點

由于缺乏可以真實模擬患者腫瘤特征的臨床前模型，阻礙了胃癌靶向抗腫瘤藥物的開發(fā)。已知的胃癌臨床治療靶點包括EGFR、HER2、HER3、PTEN、FGFR2和MET。HER2陽性、FGFR2擴增、PTEN丟失和MET擴增的PDX模型分別對曲妥珠單抗、AZD4547、AZD5363和沃利替尼敏感[28-29]。Chen等[30]對50例晚期胃癌患者PDX模型的基因組變異和分子圖譜進行分析。發(fā)現(xiàn)EGFR單克隆抗體BK011和西妥昔單抗針對具有EGFR擴增的PDX模型具有治療效果。表明PDGCX模型保留了原發(fā)瘤的異質(zhì)性，是評價靶向藥物抗腫瘤效果的有效工具。

目前，癌細胞對化療和潛在靶向藥物的抵抗性是腫瘤治療的難點。有一些被確定為潛在靶點的受體具有重疊的細胞內(nèi)信號轉導級聯(lián)，特別是PI3K/AKT/MTOR和MAPK通路[31]。這些信號級聯(lián)的激活與腫瘤細胞增殖和存活的增加以及細胞凋亡的抑制有關。Li等[32]篩選了15個PDGCX模型，并發(fā)現(xiàn)含有PI3KCA激活突變的PDGCX模型對AKT抑制劑AZD5363有抗腫瘤反應，而PTEN缺失的PDGCX模型中未觀察到顯著功效。然而，當用AZD5363和泰索帝的聯(lián)合治療可以克服PTEN缺失PDGCX模型中對泰索帝的內(nèi)在抗性。

4 評估胃癌轉移潛能的標志物

由于缺乏能夠預測預后和轉移可能性的敏感和特異的生物標記物，胃癌的成功治療仍然受到阻礙。胃癌常用的腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA24-2、CA7-24和胃蛋白酶原等，可以對胃癌進行早期的預警和診斷，對復發(fā)、轉移以及預后判斷具有重要意義。血管生成是腫瘤生長和轉移所必須的，受血管生成因子的控制。腫瘤細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)促進高通透性和大分子經(jīng)血管轉運，據(jù)報道，VEGF-A的表達與胃癌遠處血行轉移有關[33]。Jiang等[34]建立的胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌異種移植模型GA0087顯示VEGF-A、B基因高表達，肺轉移潛能高。并且在模型中檢測到循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤微栓子(CTM)和肺轉移灶。CTC的數(shù)量與肺中轉移性結節(jié)的數(shù)量相關。

研究發(fā)現(xiàn)EZH2介導的EphB3表觀遺傳抑制通過影響E-cadherin和波形蛋白的表達抑制胃癌的增殖和轉移，并且EphB3水平與GC患者的臨床特征在侵襲深度，淋巴轉移和預后方面相關[35]。Wang等[36]發(fā)現(xiàn)曲妥珠單抗+西妥昔單抗可抑制胃癌PDX模型的增殖，顯著減少轉移標志物(VEGF，MMP-7，EGFT，Ki-67和PCNA)的表達。Kasurinen等[37]首次表明胃癌中高血清可溶性MMP-14水平可作為預后不良的標志物，并且可能存在遠處轉移。Kasai等[38]通過對胃癌PDX模型進行基因表達和DNA甲基化陣列分析，篩選出TFF2、MUC13、ANG等候選基因。TFF2可作為胃癌轉移和預后不良的潛在標志物，MUC13在腸型胃癌中經(jīng)常過表達，ANG是一種血管生成因子，促進腫瘤細胞生長，與周圍的非腫瘤性胃粘膜相比，在胃癌組織中表達更高。

5 展望

彌漫型胃癌臨床易發(fā)生轉移，但PDX模型總體成功率較低，主要原因是腫瘤細胞分散于間質(zhì)組織中，單位面積的腫瘤細胞數(shù)量較少，不利于腫瘤的成功植入，因此，探索和開發(fā)這一亞型的新模式體系和治療策略是迫切需要解決的問題。Park等[39]開發(fā)了Pdx-1-Cre、Cdh1F/+、Trp53F/F、Smad4F/F(pChePS)小鼠模型，該模型自發(fā)的產(chǎn)生與人彌漫型胃癌相似的轉移性胃癌，顯示E-cadherin表達幾乎完全缺失(由Cdh1編碼)，而其余Cdh1等位基因沒有雜合性缺失(LOH)和DNA啟動子高甲基化，暗示它是彌漫型胃癌癌變的關鍵步驟。條件重編程(Conditional Reprogramming，CR)細胞技術，一種新的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，促進從患者活檢中產(chǎn)生穩(wěn)定的培養(yǎng)物，建立維持親本PDX腫瘤特征的PDX衍生細胞系，這些CR-PDX細胞株保持了親本驅(qū)動基因突變和等位基因頻率，不存在克隆漂移。通過再植入CR-PDX細胞增殖形成腫瘤，保持了PDX腫瘤的生長動力學、組織學和藥物學反應[40]。應用于胃癌PDX模型可以克服生長緩慢、植入率可變和體外缺乏持續(xù)生長等缺點，提高移植成功率，促發(fā)轉移。

抗PD1抗體等免疫調(diào)節(jié)劑在PDX模型中的應用受到限制，因為PDX模型使用的免疫缺陷小鼠缺乏成熟的免疫系統(tǒng)[41]。為了克服這一障礙，移植人類造血干細胞和祖細胞建立人源化小鼠模型可用于癌癥免疫治療研究[42]。提示人源化的胃癌PDX模型更利于轉移發(fā)生，藥物的反應性與人相似，利于藥物的篩選?？傊?，胃癌轉移的發(fā)生和諸多基因密切相關，不同的病人應該有各自的特征，隨著精準醫(yī)學時代的到來，基于已有的胃癌PDX模型，探索個體化轉移模型中腫瘤相關基因表達特征，特別是胃癌轉移相關基因表達水平的變化，可能為胃癌轉移發(fā)生機制和治療研究提供可靠的動物模型。