苜蓿黃酮的生物活性功能及其在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用

李苗苗， 靳思玉， 牛志力， 曹 陽(yáng)

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

紫花苜蓿在世界各地廣泛種植，不僅可作為草食家畜的高蛋白粗飼料，還因富含生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物在諸多領(lǐng)域（醫(yī)學(xué)、美容、農(nóng)業(yè)等）備受青睞（Gawel'等，2017； Cornara 等，2016）。 紫花苜蓿次級(jí)代謝產(chǎn)物包含大量的黃酮類(lèi)化合物，目前提取到的黃酮類(lèi)化合物有50余種（Katarzyna等，2016），干物質(zhì)基礎(chǔ)上測(cè)得總含量達(dá)到 （12.6±0.17）mg/g（Karimi等，2013）。提取純化后的黃酮添加到動(dòng)物基礎(chǔ)日糧中，在機(jī)體內(nèi)充當(dāng)自由基清除劑和金屬螯合劑（Oskoueian等，2014），發(fā)揮殺菌、抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)心血管等功能（Liu 等，2018；Martínez等，2016）。 本文著重對(duì)苜蓿黃酮的生物活性和提取工藝進(jìn)行闡述，同時(shí)簡(jiǎn)要的分析造成苜蓿黃酮含量差異的因素，旨在為苜蓿黃酮類(lèi)化合物在畜牧生產(chǎn)上的利用提供理論參考依據(jù)。

1 黃酮類(lèi)化合物分類(lèi)

根據(jù)C3結(jié)構(gòu)氧化程度和B環(huán)連接位置的不同，黃酮類(lèi)化合物主要分為黃酮及其苷類(lèi)、異黃酮類(lèi)、異黃烷及其苷類(lèi)、紫檀烷類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)、查耳酮類(lèi)等（Katarzyna等，2016）。黃酮及其苷類(lèi)的糖基部分主要以葡萄糖或葡萄糖醛酸為主，包含蘆丁、芹菜素、木犀草素、金圣草黃素、苜蓿素、麥黃酮等；異黃酮類(lèi)主要有芒柄花苷、染料木黃酮、大豆黃素、苜蓿內(nèi)酯、雞豆黃素A、考邁斯托醇等，該類(lèi)物質(zhì)具有類(lèi)雌激素樣作用；異黃烷及其苷類(lèi)主要有柚皮素、圣草酚、蒜頭素、維斯體素等；紫檀烷類(lèi)主要有美迪紫檀素等；查耳酮類(lèi)主要有異甘草素、甘草素等（趙婭敏等，2103）。苜蓿中最常用的黃酮類(lèi)化合物主要為芹菜素、木犀草素、苜蓿素。

2 苜蓿黃酮的生物活性功能

2.1 殺菌作用 畜牧生產(chǎn)中抗生素的長(zhǎng)期不規(guī)范使用導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品抗生素殘留成為亟待解決的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)“天然、綠色”抗菌劑成為研究熱點(diǎn)，黃酮類(lèi)化合物已被證實(shí)具有一定的抑菌作用 （Babii等，2018）。黃酮類(lèi)化合物主要通過(guò)抑制菌體內(nèi)能量生成（抑制需氧菌糖代謝來(lái)抑制三羧酸循環(huán)、阻礙病原菌能量攝取、破壞細(xì)胞完整性、增加細(xì)胞通透性）、抑制菌體內(nèi)酶活性（抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶活性、抑制還原酶/脫氫酶活性）、抑制蛋白質(zhì)核酸合成等來(lái)發(fā)揮殺菌作用（楊彩霞等，2014）。通過(guò)對(duì)提取的苜蓿黃酮進(jìn)行抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)大腸埃希氏桿菌的最小抑菌濃度（MIC）值為0.40 mg/g，對(duì)金黃色葡萄球菌MIC值為0.70 mg/g（董曉寧等，2014）。對(duì)7種苜蓿的水醇提取物進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物含量為5.54～11.67 mg/g，抗微生物潛力的初步測(cè)定表明，苜蓿提取物顯示出抗菌活性，對(duì)于部分革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌，MIC值分別為31.3 μg/mL 和 125 μg/mL（Rodrigues等，2013）。

2.2 抗氧化作用 紫花苜蓿中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，其可通過(guò)抑制自由基產(chǎn)生和清除自由基反應(yīng)發(fā)揮良好的抗氧化特性。隨著苜蓿黃酮質(zhì)量濃度增加，其對(duì)DPPH自由基的清除速率逐漸增大，當(dāng)苜蓿黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.78 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)到50%；同時(shí)通過(guò)鐵還原抗氧化能力的方法得出，隨著黃酮濃度增加，F(xiàn)e2+-TPTZ復(fù)合體形成量增加，表現(xiàn)出的鐵還原能力越強(qiáng)，總黃酮質(zhì)量濃度與鐵還原抗氧化能力呈線性相關(guān)，R2=0.9675（劉香萍等，2016）。苜蓿黃酮還具有激活機(jī)體抗氧化體系的功能，其可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性，提高抗氧化因子合成，激活機(jī)體內(nèi)固有的抗氧化程序，發(fā)揮自身抗氧化作用。當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除失衡，過(guò)量活性氧的產(chǎn)生和積累導(dǎo)致神經(jīng)元產(chǎn)生損傷時(shí)，抗氧化劑黃酮類(lèi)化合物也能通過(guò)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷來(lái)發(fā)揮抗氧化作用（Xu等，2017）。

2.3 抗腫瘤作用 黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路的激活，干預(yù)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞周期蛋白調(diào)控的方式，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的發(fā)生 （Gatouillat等，2014）。人胃癌細(xì)胞MGC-803體外培養(yǎng)時(shí)加入苜蓿黃酮，發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)下調(diào)周期蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6的表達(dá)，引起細(xì)胞周期紊亂，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖；然后通過(guò)活化促凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3、PARP， 抑制凋亡蛋白 Bcl-2 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且這種抑制作用存在著時(shí)間和劑量依賴(lài)效應(yīng)（左曉昕等，2016）。黃酮類(lèi)化合物還可以通過(guò)增加胞內(nèi)Ca2+水平，降低細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位，促進(jìn)線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子移位到細(xì)胞核發(fā)揮凋亡效應(yīng)（王艷芳等，2003）。

2.4 脂類(lèi)代謝 食物中脂肪的消化和吸收需要脂肪酶的參與，胰脂肪酶占脂肪分解活性的50% ～70%，而胃脂肪酶占10%～30%，腸道中的三酰甘油被脂肪酶水解轉(zhuǎn)化為單甘油和脂肪酸后被機(jī)體吸收代謝（Birari等，2007）。黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)抑制脂肪酶活性減少脂肪分解，降低機(jī)體的吸收，阻止肥胖疾病發(fā)生。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)脂肪酶活性的抑制與附著于C3位的?；滈L(zhǎng)度存在直接關(guān)系（R2=0.91）（Gonzales等，2015）。

2.5 類(lèi)雌激素樣作用 含有雜環(huán)酚羥基結(jié)構(gòu)的植物雌激素因相似于機(jī)體內(nèi)雌激素結(jié)構(gòu)，能結(jié)合體內(nèi)雌激素受體，發(fā)揮較弱的雌激素樣作用。如大豆黃酮和染料木素等均能調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子等激素的分泌，促進(jìn)動(dòng)物組織、器官發(fā)育；還可以調(diào)節(jié)垂體促黃體素和促卵泡素等性激素的合成和分泌來(lái)影響動(dòng)物的繁殖性能 （Collins-Burow等，2012）。苜蓿黃酮灌胃性未成熟的雌性大鼠和成年大鼠，在性未成熟的雌性大鼠中，高劑量組促性腺激素釋放激素降低，促卵泡生成素受體的表達(dá)量提高，低劑量組黃體生成素和芳香化酶（CYP19A-1）的表達(dá)量提高；苜蓿黃酮能降低促成年大鼠中性腺激素釋放激素的表達(dá)量，提高促黃體生成素受體和CYP19A-1的表達(dá)量。苜蓿黃酮可通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，并通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制抑制促性腺激素釋放激素的表達(dá)，影響機(jī)體性腺軸上其他相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮類(lèi)雌激素樣作用（王偉等，2014）。

2.6 增強(qiáng)免疫力 黃酮類(lèi)化合物通過(guò)作用于機(jī)體免疫器官、調(diào)節(jié)垂體生長(zhǎng)激素的分泌、刺激免疫細(xì)胞抗體的合成，調(diào)節(jié)體液免疫和非特異性免疫，改善機(jī)體的免疫機(jī)能，進(jìn)而提高免疫力。在小鼠日糧中添加適量黃酮，可促進(jìn)小鼠DNA和蛋白質(zhì)合成，加速細(xì)胞的增殖，通過(guò)IFN-γ mRNA的高表達(dá)和IFN-γ的高分泌，激活NK細(xì)胞，刺激B細(xì)胞分泌抗體，增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的能力 （唐浩國(guó)等，2007）。在LPS誘導(dǎo)下，苜蓿黃酮可能通過(guò)抑制 TLR2/MyD88/p38信號(hào)，降低 TNF-α、IL-1β 和IL-6等炎癥因子基因的表達(dá)量，保護(hù)細(xì)胞免受炎性損傷（占今舜等，2018）。

3 苜蓿黃酮常用提取工藝

苜蓿中黃酮類(lèi)化合物常用的提取工藝主要有有機(jī)溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、超聲波輔助提取法。

3.1 有機(jī)溶劑浸提法 有機(jī)溶劑浸提法提取工藝簡(jiǎn)單、操作方便、條件容易控制、設(shè)備費(fèi)用較低、提取劑容易消除、工業(yè)化可行性強(qiáng)，但提取效率低、試劑損耗大。尹衛(wèi)等（2016）采用醇提法，以單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)方法確定苜蓿黃酮類(lèi)物質(zhì)提取效果因素由大到小依次為料液比、乙醇濃度、提取溫度，并優(yōu)化最佳提取工藝為料液比1∶20、提取溫度70℃、乙醇濃度70%，黃酮類(lèi)物質(zhì)提取量為0.0237 mg/mL。

3.2 超聲波輔助提取法 超聲波提取法是采用超聲波的強(qiáng)烈振蕩、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)的原理，使樣品處于高溫高壓的環(huán)境，隨著激波的產(chǎn)生，細(xì)胞受壓破碎，釋放胞內(nèi)物質(zhì)，致使目標(biāo)物質(zhì)溶解在溶劑的過(guò)程。超聲輔助提取是從紫花苜蓿中獲得黃酮的有效方法，與常規(guī)提取方法相比，使用超聲輔助提取的提取物中總黃酮含量和抗氧化活性更高（Jing 等，2015）。劉香萍等（2016）通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取苜蓿黃酮工藝得出，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取溫度67℃、超聲波功率100 MHz、提取時(shí)間40 min時(shí)，黃酮的得率為5.29 mg/g。許英一等（2018）采用乙醇浸提、超聲波輔助水提取和超聲波輔助乙醇提取3種方法進(jìn)行苜蓿黃酮的提取發(fā)現(xiàn)，總黃酮得率分別為（4.32±0.08）、（4.59±0.08）、（5.44±0.12）mg/g， 對(duì)超聲波輔助乙醇提取黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化后得出，苜蓿黃酮的得率達(dá)到6.43 mg/g。超聲波輔助提取技術(shù)提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、適應(yīng)性廣泛、提取效率相對(duì)較高、提取物中純度較大，但其提取工藝噪聲污染嚴(yán)重。

3.3 微波輔助提取法 微波輔助提取通過(guò)強(qiáng)大的穿透能力到達(dá)樣品的微管束和腺胞系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生高壓高溫破壞細(xì)胞屏障，釋放細(xì)胞內(nèi)容物。微波輔助提取具有適用范圍廣、目標(biāo)選擇性強(qiáng)、需求設(shè)備簡(jiǎn)便、萃取效率高、節(jié)省時(shí)間和萃取所需試劑污染較小、試驗(yàn)重復(fù)率高等特點(diǎn)。黃曉慧等（2017）通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到優(yōu)化微波輔助提取苜蓿黃酮的工藝為提取時(shí)間30 min、乙醇濃度60%、微波功率600 W、固液比1∶15、提取溫度80℃。張羽男等（2014）采用微波輔助提取法提取苜蓿黃酮，確定其最佳工藝為pH 10.0、固液比1∶50、功率140 W、提取時(shí)間30 s，提取率為14.587 mg/g。

4 苜蓿黃酮含量的差異

植物次級(jí)代謝物含量和生物活性如抗氧化活性、抗炎癥等呈正相關(guān)（Barros等，2007），并可在一定范圍內(nèi)受植物生長(zhǎng)環(huán)境的調(diào)節(jié)。其中，黃酮的含量因土壤類(lèi)型、日照、降雨等因素在個(gè)體中差異較大（Pandey等，2009）。鹽度是能夠改變植物中多酚化合物含量的主要因素之一，高鹽度的土壤可誘導(dǎo)植物抗氧化酶活化和抗氧化化合物的合成增加（Gupta等，2014）。研究表明，植物生長(zhǎng)土壤的NaCl濃度增加后，黃酮類(lèi)化合物含量有所增加（Colla等，2013）。也有研究表明，隨著紫花苜蓿植株的生長(zhǎng)總黃酮含量逐漸下降，結(jié)實(shí)期顯著低于前面各個(gè)時(shí)期，并且以4年生紫花苜蓿中黃酮含量最高（高微微，2004）。采用不同光質(zhì)和光照時(shí)間處理紫花苜蓿芽苗發(fā)現(xiàn)，白光最有利于紫花苜蓿黃酮類(lèi)化合物的積累，且光照4～8 h時(shí)有利于黃酮類(lèi)化合物的產(chǎn)生（馮娜娜，2016）。適當(dāng)?shù)母珊狄灿欣邳S酮類(lèi)化合物生物合成基因的表達(dá)，對(duì)于苜蓿黃酮類(lèi)化合物的積累起到促進(jìn)作用（Kang，2011）。

5 苜蓿黃酮在反芻動(dòng)物方面的應(yīng)用

5.1 在牛日糧中的應(yīng)用 動(dòng)物日糧中添加黃酮類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)酚羥基氫原子可與過(guò)氧自由基相結(jié)合生成黃酮自由基，再與其他自由基發(fā)生反應(yīng)終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，提高動(dòng)物機(jī)體清除自由基和抗氧化能力；同時(shí)黃酮類(lèi)化合物可通過(guò)降低動(dòng)物血液黏度和紅細(xì)胞凝聚性，促進(jìn)血液循環(huán)，提高糖、脂和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝，從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化，促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成，提高機(jī)體的非特異性免疫。

在奶?；A(chǔ)日糧中添加60 mg/kg BW苜蓿黃酮發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)蛋白質(zhì)的吸收和代謝，改變牛奶的成分，調(diào)節(jié)瘤胃中的微生物群體以增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化的趨勢(shì)，提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性以改善抗氧化性，抑制淋巴細(xì)胞的凋亡以及調(diào)節(jié)血液中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而改善奶牛的非特異性免疫（Zhan 等，2017）。

5.2 在綿羊日糧中的應(yīng)用 在綿羊基礎(chǔ)日糧中添加苜蓿黃酮提取物發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、生長(zhǎng)激素和胰島素生長(zhǎng)因子的量，調(diào)節(jié)綿羊的抗氧化性能和激素分泌，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)（王凱等，2017）。在薩福克小尾寒羊雜交羊基礎(chǔ)日糧中添加苜蓿黃酮發(fā)現(xiàn)，其可調(diào)節(jié)綿羊脂類(lèi)代謝，提高氮的利用效率，維持體內(nèi)能量代謝及鈣磷平衡，其血清中總抗氧化能力、超氧化物歧化酶、超氧陰離子清除能力和羥基自由基清除能力有升高趨勢(shì)，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的潛能。建議添加量為0.2%（劉艷豐等，2016；王夢(mèng)竹等，2015）。

6 小結(jié)

盡管紫花苜蓿黃酮廣泛用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療多種疾病，但到目前為止大多數(shù)研究都在體外進(jìn)行，對(duì)體內(nèi)的研究相對(duì)較少，且部分活性理論還未完全闡明，還沒(méi)有足夠的臨床證據(jù)表明其效果。因此，需要標(biāo)記物來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化的分析活性化合物的功效。未來(lái)的研究應(yīng)側(cè)重于樣品制備技術(shù)和分離工具的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，以便分析苜蓿提取物發(fā)揮功效的主要成分。因此，開(kāi)發(fā)用于純化單個(gè)生物活性化合物的先進(jìn)方法將便于將來(lái)能夠闡述其對(duì)動(dòng)物有機(jī)體的作用機(jī)制。來(lái)自樣品測(cè)定數(shù)據(jù)，動(dòng)物模型研究以及使用標(biāo)準(zhǔn)化提取物或單個(gè)化合物的可靠臨床試驗(yàn)對(duì)于證實(shí)其活性和確定有效劑量是必要的。