微流控芯片與基因診斷關(guān)系的研究進(jìn)展

張曉杰 費(fèi)洪新

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

微流控芯片(MC)也稱(chēng)為芯片實(shí)驗(yàn)室，其已經(jīng)廣泛于醫(yī)學(xué)、生物、電子、流體、化學(xué)等領(lǐng)域〔1,2〕，且MC可把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)、擴(kuò)增、分析等集成到一塊幾微米至幾百微米尺度的芯片上并自動(dòng)完成所有基本過(guò)程。目前，MC已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到醫(yī)學(xué)基因診斷(GD)方面，例如基因多態(tài)性檢測(cè)〔3〕、基因高效性測(cè)序〔4〕、基因快速性擴(kuò)增〔5,6〕等，為此，本文主要對(duì)MC與GD關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 MC簡(jiǎn)介

1.1MC相關(guān)概念 MC主要是指在幾微米至幾百微米的通道內(nèi)將系統(tǒng)化、規(guī)范化、程序化的操作單元集成到一塊芯片上，且對(duì)微小體積的液體樣品進(jìn)行系統(tǒng)化、規(guī)范化、處理或操作的一門(mén)系統(tǒng)科學(xué)和技術(shù)〔7〕。微陣列芯片主要是指將一個(gè)或者多個(gè)相同或者相似的系統(tǒng)化、規(guī)范化、程序化的操作單元或單元群平行地集成在同一芯片上的一門(mén)系統(tǒng)科學(xué)和技術(shù)〔8,9〕。生物芯片主要是指將已經(jīng)知曉的生物信息包括DNA與RNA核酸序列固定于經(jīng)過(guò)表面修飾的載體上，以此進(jìn)行特異性地檢測(cè)未知DNA核酸序列、RNA核酸序列的一門(mén)系統(tǒng)科學(xué)和技術(shù)〔10,11〕。

1.2MC制備方法 實(shí)驗(yàn)室制備MC需要采用電子計(jì)算機(jī)輔助軟件〔12，13〕設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)易型或者復(fù)雜型的MC圖紙，應(yīng)用激光雕刻技術(shù)〔14,15〕在由聚二甲基硅氧烷、聚吡咯烷酮、線性聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、羥乙基纖維素、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酯等混合材料制備的雙面黏性薄膜〔16〕上切割出微米級(jí)、納米級(jí)的MC流體通道，將由聚二甲基硅氧烷制備的蓋片、雙面黏性薄膜、基片采用高溫加熱〔17,18〕的方式進(jìn)行封接組裝，然后將制備好的MC與注射器、注射泵、熒光倒置顯微鏡、圖像記錄儀等連接起來(lái)，以此就建立起MC反應(yīng)系統(tǒng)，隨后還需要進(jìn)行MC表面修飾化、抗體固定化，其中前者多采用巰基-馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)〔19〕硅烷化耦聯(lián)法為MC表面修飾方法，而后者多采用鏈霉親和素-生物素〔20，21〕親合法進(jìn)行抗體固定的優(yōu)化，之后就可以進(jìn)行MC的反應(yīng)、分離、檢測(cè)、擴(kuò)增、分析。

2 MC與GD的關(guān)系

2.1MC與基因多態(tài)性檢測(cè)的關(guān)系

2.1.1MC檢測(cè)基因缺失 一般而言，基因缺失主要是指高等動(dòng)物、低等動(dòng)物基因由于受到體內(nèi)外各種因素的干擾促使機(jī)體部分基因區(qū)域缺如，由此將會(huì)影響高等動(dòng)物、低等動(dòng)物的部分結(jié)構(gòu)和功能。目前，MC可以將高等動(dòng)物、低等動(dòng)物基因的大片段缺失區(qū)域進(jìn)行確定，例如X 染色體連鎖的隱性遺傳病抗肌萎縮蛋白基因的缺失，使用MC可以進(jìn)行檢測(cè)分析。國(guó)外一項(xiàng)研究顯示，通過(guò)直接監(jiān)控微流體平臺(tái)單菌株生長(zhǎng)，可以檢測(cè)大腸桿菌菌株中的基因組缺失效應(yīng)，與野生型菌株相比，清潔基因組菌株的平均生長(zhǎng)速度下降、平均滯后時(shí)間延長(zhǎng)，且個(gè)體細(xì)胞生長(zhǎng)速度和滯后時(shí)間之間直接相關(guān)，會(huì)表明清潔基因組種群更加不均勻，可見(jiàn)單菌株MC可以揭示細(xì)微的單個(gè)菌株反應(yīng)〔22〕。另外，使用MC系統(tǒng)能夠?qū)⒃S多不同出芽酵母菌株高通量地開(kāi)展研究，選擇野生型芽殖酵母和62個(gè)不同芽殖酵母大小對(duì)照相對(duì)基因缺失株進(jìn)行掃描，將可以獲得不同基因缺失菌株的母細(xì)胞倍增時(shí)間、子細(xì)胞倍增時(shí)間、母細(xì)胞大小、子細(xì)胞大小等結(jié)果，可見(jiàn)MC可以對(duì)基因缺失進(jìn)行基因診斷〔23,24〕。一項(xiàng)亞細(xì)胞水平研究報(bào)告顯示，線粒體是人體和動(dòng)物細(xì)胞的能量產(chǎn)生和代謝中心，為維持生理功能提供大部分能量，其在細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是其缺失有效的修復(fù)系統(tǒng)，線粒體DNA受到的氧化損傷要高得多，而使用MC還可以應(yīng)用于線粒體DNA缺失的診斷，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，MC系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的樣品和試劑消耗較少，提取的線粒體DNA提取率較高，可以在150 min內(nèi)自動(dòng)化進(jìn)行所有的檢測(cè)過(guò)程，可見(jiàn)MC將為分析線粒體DNA缺失提供了一個(gè)有力的工具〔25〕。近年來(lái)國(guó)外一項(xiàng)研究顯示，MC可以診斷非小細(xì)胞肺癌常規(guī)樣本表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因缺失且顯示非小細(xì)胞肺癌與EGFR外顯子19缺失明顯相關(guān)〔26〕。

2.1.2MC檢測(cè)基因重排 基因重排主要是指高等動(dòng)物、低等動(dòng)物基因從遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的地方且轉(zhuǎn)移到距離啟動(dòng)子比較近的地方，從而促使各類(lèi)動(dòng)物基因重新啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方式，其結(jié)合了傳統(tǒng)誘變技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、基因突變技術(shù)等。研究顯示，基因重排利于消化道淋巴瘤〔27〕和非小細(xì)胞肺癌〔28〕的診斷。國(guó)外研究顯示，通常高等動(dòng)物、低等動(dòng)物T、B 惡性淋巴瘤多表現(xiàn)T 細(xì)胞受體(TCR)基因、免疫球蛋白(Ig)H基因高度表達(dá)，通過(guò)以DNA交聯(lián)染料(YO-PRO)-1為熒光標(biāo)記染料標(biāo)記基因片段，經(jīng)MC分析后可以明確單一IgH或TCR 基因重排方式，且明顯節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，以此最終診斷出T、B 惡性淋巴瘤〔29,30〕。國(guó)外研究顯示，拷貝數(shù)變異(CNV)將會(huì)導(dǎo)致基因組變異且是引起基因組重排的一種現(xiàn)象，通過(guò)MC結(jié)合微流體毛細(xì)管電泳可以有效地檢測(cè)基因重排且此方法非?？煽俊?1〕。

2.1.3MC檢測(cè)微小衛(wèi)星DNA 微小衛(wèi)星DNA主要是指廣泛存在于高等動(dòng)物、低等動(dòng)物基因組中長(zhǎng)度100～500 bp多態(tài)性的DNA 序列且微小衛(wèi)星DNA核心序列僅僅是2～5 bp，其也稱(chēng)為短串聯(lián)重復(fù)(STR)〔32,33〕，使用MC檢測(cè)可以積極克服傳統(tǒng)的垂直板凝膠電泳背景模糊、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、誤差較大等，但是也有相對(duì)不穩(wěn)定〔34〕的部分缺點(diǎn)，MC檢測(cè)應(yīng)用的范圍非常廣闊例如脆性X綜合征(FraX)精氨酸編碼的CGG STR序列、造血干細(xì)胞移植(HSCT)后可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)〔35〕、法醫(yī)鑒定所需的多重?cái)U(kuò)增STR基因座(DYS390、DYS393、DYS439)〔36,37〕等，這與通過(guò)STR來(lái)分析識(shí)別MC系統(tǒng)的快速化(3 h)〔38〕、模塊化、集成化(同時(shí)檢測(cè)17個(gè)STR)〔39〕的積極優(yōu)勢(shì)有一定關(guān)系。國(guó)外法醫(yī)學(xué)資料研究顯示，MC可以通過(guò)檢測(cè)微小衛(wèi)星DNA來(lái)進(jìn)行法醫(yī)篩選和基因分型，尤其是可以快速對(duì)那些在爆炸或恐怖事件附近被拘留的嫌犯、企圖非法出入境的被拘留者、大規(guī)模災(zāi)害的受害者等人群，可見(jiàn)微小衛(wèi)星DNA快速篩查就顯得尤為重要，使用改進(jìn)的Agilent 2100生物分析儀可以在80 s內(nèi)檢測(cè)6個(gè)微小衛(wèi)星DNA，且精確度為0.09～0.21 bp、分辨率值為2.5～4.1 bp，可見(jiàn)MC檢測(cè)微小衛(wèi)星DNA具有快速化、準(zhǔn)確化、高效化等基本特點(diǎn)〔40〕。

2.1.4MC檢測(cè)基因突變 基因突變主要是指高等動(dòng)物、低等動(dòng)物受到各種因素的作用下，基因出現(xiàn)改變，包括單個(gè)堿基、多個(gè)堿基的改變，使用MC可以檢測(cè)基因突變，例如秀麗隱桿線蟲(chóng)cwn-1突變〔41〕、循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞基因突變〔42〕。一般而言，所有疾病相關(guān)基因逐漸被克隆基因突變包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性所取代，其中，單鏈構(gòu)象多態(tài)性〔43,44〕主要是指等長(zhǎng)DNA單鏈出現(xiàn)單個(gè)堿基差異，隨后由于鏈內(nèi)彼此作用而形成構(gòu)象差異，使用熒光染料標(biāo)記引物，使用MC分析乳腺癌易感基因，可以在2 min內(nèi)就可以對(duì)乳腺癌易感基因的單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)，這比毛細(xì)管電泳所需的時(shí)間要明顯縮短；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性〔45,46〕是指某些特殊的點(diǎn)突變會(huì)促使某些特異性的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)缺失，使用MC可以檢測(cè)分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。國(guó)外研究資料顯示，非小細(xì)胞肺癌樣品進(jìn)行表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變的驗(yàn)證研究測(cè)試可以使用MC來(lái)進(jìn)行，通過(guò)一種快速而靈敏MC技術(shù)可以將EGFR快速檢測(cè)出來(lái)且成本低廉〔47〕。

2.2MC與基因高效性測(cè)序的關(guān)系 基因測(cè)序主要是指采用先進(jìn)的方法對(duì)高等動(dòng)物、低等動(dòng)物核酸序列進(jìn)行系統(tǒng)化、規(guī)范化、快速化分析〔48,49〕，此過(guò)程需要的工程量尤為巨大。目前，對(duì)MC實(shí)驗(yàn)室主要采用96根陣列毛細(xì)管電泳對(duì)基因序列進(jìn)行系統(tǒng)化測(cè)定，雖在一定程度上加快了人類(lèi)基因組項(xiàng)目，但是還不能實(shí)現(xiàn)高效、靈敏、快速、價(jià)廉、自動(dòng)、準(zhǔn)確等基本特點(diǎn)，而MC可以實(shí)現(xiàn)高效基因測(cè)序，例如腸道微生物基因測(cè)序〔50〕、酵母基因測(cè)序〔51〕、肺癌腫瘤細(xì)胞基因測(cè)序〔52〕等檢測(cè)效率非常高。

2.3MC與基因快速性擴(kuò)增的關(guān)系 基因快速性擴(kuò)增通常是指采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)將目標(biāo)靶點(diǎn)DNA片段呈倍數(shù)量增加并通過(guò)電泳方式將目標(biāo)靶點(diǎn)DNA片段識(shí)別、分離、分析等〔53，54〕，此過(guò)程有需要較多的試劑、加熱時(shí)間長(zhǎng)、冷卻時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)。目前，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)基因快速性擴(kuò)增可采用MC，通過(guò)將MC與PCR結(jié)合，以此建立起微型化的MC-PCR反應(yīng)體系，將會(huì)明顯克服PCR的缺點(diǎn)包括PCR需要較多的試劑、加熱時(shí)間長(zhǎng)、冷卻時(shí)間長(zhǎng)等，同時(shí)MC-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增產(chǎn)物很容易與樣品分離且可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化、集成化、微型化。目前，MC-PCR反應(yīng)體系可以檢測(cè)土壤細(xì)菌基因〔55〕、腫瘤細(xì)胞基因〔56〕、血液細(xì)菌基因〔57〕等，足見(jiàn)其應(yīng)用十分廣闊。

綜上，MC可以應(yīng)用到醫(yī)學(xué)GD方面，例如基因多態(tài)性檢測(cè)、基因高效性測(cè)序、基因快速性擴(kuò)增等，可見(jiàn)MC與GD均是密切相關(guān)的，推測(cè)使用MC將是今后GD檢測(cè)分析的新方法之一。