黃芩藥材的微乳薄層色譜鑒別方法研究*

潘弟儀，陳金興，黃曉冰，吳 涵，王 凌

（廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510360）

微乳薄層作為新型色譜技術，展開效果好，色譜性能穩(wěn)定，重復性好，可用于中藥材、中藥飲片和中成藥的分離鑒定［1］。微乳是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按適當比例自發(fā)形成的無色透明、各向同性、低黏度的熱力學穩(wěn)定體系［2］，具有很大的表面積、強大的增溶效果及超低界面張力有利于提高色譜的分離效率［3］。微乳薄層色譜法目前處于初創(chuàng)階段，研究基本上是單純改變微乳液含水量對微乳進行優(yōu)化［4-8］，不能全面反映其他成分對分離效果的影響，因此方法學存在明顯缺陷。2015年版《中國藥典（一部）》的黃芩藥材薄層鑒別方法采用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑，展開劑極性差異大，不易混合均勻，容易分層，影響展開效果。本研究中采用微乳液為展開劑，通過優(yōu)化微乳液各成分比例，全面分析了微乳液中各成分對微乳薄層展開效果的影響，篩選能用于黃芩藥材薄層鑒別的最優(yōu)微乳展開劑，效果較好?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WFH-203B型暗箱式三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；MSE125P-OCE-DU型電子分析天平（賽多利斯公司）；超聲波清洗機（寧波海曙科生超聲設備有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；10 μL定量毛細管（北京先驅威鋒技術開發(fā)公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品、黃芩素對照品均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供，純度高于98%；黃芩對照藥材（廣東省藥品檢驗所，批號為120955-201309）；黃芩藥材（產地河北，嶺南藥業(yè)有限公司，批號分別為1603002，1605001，1607001）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

稱取黃芩苷和黃芩素對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含1 mg和0.5 mg的溶液，作為黃芩苷及黃芩素對照品溶液。取黃芩對照藥材及黃芩藥材，按《中國藥典》方法制成對照品溶液及供試品溶液。取十二烷基磺酸鈉（SDS）加純化水攪拌溶解，加入正丁醇、正庚烷，混勻成均一溶液，放置24 h即得微乳液。取微乳液加入適量改性劑甲酸攪拌成均一溶液，作為展開劑。

2.2 薄層層析

取2.1項下溶液樣品10 μL，分別點于聚酰胺薄膜上，分別以各微乳液或甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3 ∶1 ∶2）為展開劑（需預飽和 30 min），展距為 8 cm，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在對照品溶液相應位置上顯相同暗色斑點。微乳薄層紫外光檢視后，噴以2%FeCl3乙醇溶液，日光下檢視，觀察斑點個數(shù)。

2.3 單因素試驗考察展開劑效果的影響

2.3.1 甲酸

取微乳液［SDS-正庚烷-正丁醇-水（27∶63∶10∶300，W／W）］，加入甲酸，得系列溶液（10 ∶0，9.5 ∶0.5，9 ∶1，8.5 ∶1.5，8 ∶2，V／V），混勻作為展開劑，按 2.2 項下方法進行薄層層析，展開效果見表1?？梢?，隨著微乳液展開劑甲酸比例的增加，黃芩苷和黃苷素的Rf值均逐漸增大，各斑點間分離度更好，但展開斑點出現(xiàn)拖尾、擴散現(xiàn)象；隨著甲酸用量的逐漸增加，展開時間也逐漸縮短。微乳液-甲酸（9∶1）斑點的分離度好，展開時間適中，故確定甲酸用量為10%。

表1 甲酸對黃芩藥材展開效果的影響

微乳液含水量：固定SDS-正丁醇-正庚烷（27∶63 ∶10，W／W），配制含水量為 50%，60%，70%，75%，80%，85%，90%（W／W）的系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）為展開劑，按2.2項下方法進行薄層層析，展開效果見表2?？梢姡S著微乳液含水量的增加，Rf值逐漸降低。微乳液含水量增大，分離度顯著降低，展開斑點減少，并出現(xiàn)擴散拖尾現(xiàn)象，但含水量過低時，紫外光下暗色斑點模糊，不利于觀察，且展開時間顯著增加，亦不利于薄層層析。微乳含水量為75%時，各斑點分離效果理想，展開時間適中，故確定微乳含水量為75%。

SDS：固定正丁醇-正庚烷 -水（63∶10∶300，W／W），SDS 取 4.00，5.00，6.00，6.75，8.00，9.00 g，加純化水75 mL 溶解，加入正丁醇 15.75 g，正庚烷 2.5 g，配制成系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）為展開劑，按2.2項下方法進行薄層層析，展開效果見表3?？梢姡S著SDS用量的增加，Rf值稍有下降。SDS用量為4.00 g時，斑點稍有擴散；用量增加到8.00 g時，紫外光下暗色斑點逐漸變得模糊，展開時間也逐漸增加，不利于薄層層析及結果的觀察；SDS用量為 5.00～6.75 g時，各斑點分離效果理想，斑點清晰，展開時間適中，均可作為微乳液中SDS用量。

表2 微乳含水量對黃芩藥材展開效果的影響

表3 SDS對黃芩藥材展開效果的影響

正丁醇：固定 SDS-正庚烷-水（27∶10∶300，W／W），分別取 SDS 6.75 g，正庚烷 2.5 g，純化水 75 mL，正丁醇用量分別為 11.00，13.00，15.00，15.75，17.00，19.00 g，配制成系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）為展開劑，按2.2項下方法進行薄層層析，展開效果見表4?？梢姡〈加昧繉S芩藥材展開效果影響并不大，正丁醇用量在11.00～17.00 g時，各斑點分離效果理想，斑點清晰，均可作為微乳液中正丁醇用量。

表4 正丁醇對黃芩藥材展開效果的影響

正庚烷：固定 SDS-正丁醇 -水（27∶63∶300，W／W），分別取 SDS 6.75 g，正丁醇 15.75 g，純化水 75 mL，正庚烷用量分別為 1.0，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0 g，配制系列微乳液，以微乳液-甲酸（9∶1）為展開劑，按2.2項下方法進行薄層層析，展開效果見表5?？梢?，正庚烷用量對黃芩藥材展開效果影響并不大，正庚烷在2～5 g時，各斑點分離效果理想，斑點清晰，均可作為微乳液中正庚烷用量。

表5 正庚烷對黃芩藥材展開效果的影響

2.4 與普通有機溶劑系統(tǒng)的比較

以微乳液［SDS-正丁醇-正庚烷-水（27∶63∶10∶300，W／W）］-甲酸（9∶1）為微乳展開劑，另按藥典方法以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為普通有機溶劑系統(tǒng)展開劑，按2.2項下方法進行薄層層析，結果見圖1。可見，微乳液的薄層層析與普通溶劑系統(tǒng)比較，分離度相當，但斑點更清晰、圓整，且操作簡便，試驗條件寬容，展開穩(wěn)定性好，更適用于黃芩藥材的薄層鑒別。

圖1 薄層色譜圖

3 討論

微乳液是一個復雜的多組分體系，可變因素較多，明確各因素對色譜分離的影響，對提高分離效率至關重要。微乳展開劑的構成絕大部分為SDS-正丁醇-正庚烷-水［3-9］，但未系統(tǒng)闡明微乳液各成分對展開效果的影響。前期試驗也證實，該微乳液體系更適用于黃芩藥材的薄層分離。由本研究結果可見，微乳液含水量對薄層層析效果影響最大，含水量低可提高物質的分離度，但同時也因展開劑黏稠度增加而使展開時間顯著延長，不利于薄層層析；另外，其他因素對薄層層析物質的分離度均無太大影響，但各成分比例不同會影響色譜圖的清晰度。其中，甲酸、SDS用量會對展開時間產生影響，故需綜合圖譜的清晰度及展開所需時間而篩選最優(yōu)配比。

微乳液［SDS-正丁醇-正庚烷-水（27∶63∶10∶300，W／W）］可作為黃芩藥材鑒別的新型展開劑，該微乳體系也是目前報道采用最多的微乳展開劑［6-9］，可用于多種藥材的黃酮類成分及中成藥制劑中多種成分的薄層分離鑒別。因此，可初步推斷采用該配比微乳液即可大致判斷微乳展開劑是否適用于其他藥材及制劑的薄層層析，可用于多種藥材及制劑微乳薄層適用性考察，為微乳薄層推廣應用提供簡便的篩選方法。

值得注意的是，除了SDS-正丁醇-正庚烷-水組成的微乳液外，亦可采用其他微乳體系對中藥材進分離鑒定［10-11］。本研究結果對微乳體系中表面活性劑、助表面活性劑、油相種類的篩選均有較大的研究意義，今后需加強研究，進一步推廣微乳薄層在中藥分離鑒別中的應用。