Cdk13表達對神經(jīng)元軸突伸長的影響

王榮躍 魯文潔 邱海凡 戴芬

[摘要] 目的 探討智力障礙相關基因Cdk13對神經(jīng)軸突伸長的影響。 方法 通過基因敲除模型、質粒細胞轉染等方法，熒光共聚焦顯微鏡成像技術檢測神經(jīng)元軸突的形態(tài)，觀察軸突伸長的變化。 結果 Cdk12和Cdk13在神經(jīng)系統(tǒng)中有表達，在敲除Cdk12和Cdk13后軸突長度比對照組減少，兩者比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05），敲除Cdk12和Cdk13基因后Cdk5 mRNA水平降低。 結論 Cdk13和Cdk12的表達對神經(jīng)元軸突的生長至關重要，其失活會引起神經(jīng)元軸突形態(tài)異常，可能是導致智力障礙的病理機制。

[關鍵詞] 智力障礙;Cdk13;Cdk12;神經(jīng)元;軸突伸長

[中圖分類號] R446.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）33-0043-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of mental retardation related gene Cdk13 on the axon elongation of neurons. Methods The gene knockout model， plasmid cell transfection and other methods as well as the fluorescence confocal microscopic imaging technique were used to detect the morphology of neuron axons and observe the changes of axon elongation. Results Cdk12 and Cdk13 were expressed in the nervous system. After knocking out Cdk12 and Cdk13， the length of axon was decreased compared with the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. The Cdk5 mRNA level was decreased after knocking out Cdk12 and Cdk13 genes. Conclusion The expression of Cdk13 and Cdk12 is critical for the growth of neuronal axons and their inactivation leads to abnormal morphology of neuron axons， which may be the pathological mechanism leading to mental retardation.

[Key words] Mental retardation; Cdk13; Cdk12; Neuron; Axonal elongation

智力障礙（Mental retardation）是由多種因素引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為智力低于同齡小孩水平，并伴有社會適應能力缺陷的一組疾病[1，2]。發(fā)病率高，全世界發(fā)病率為1%～3%[3]。隨著研究的深入，遺傳因素占的比重越來越高，包括染色體病、基因組病、單基因病或多基因突變等。目前已知Cdk13（cyclin-dependent kinase-13）與非綜合征型發(fā)育遲緩相關的遺傳基因[4，5]。Wang R等[6]在前期研究發(fā)現(xiàn)Cdk13基因缺失會導致智力低下，但是其發(fā)病機制仍不清楚。

蛋白激酶是一種能影響細胞周期、分化、代謝、細胞死亡和各種其他關鍵細胞過程的關鍵調節(jié)因子。Cdk12和Cdk13具有92%的同一性的蛋白激酶結構，并且已知與細胞周期蛋白L和細胞周期蛋白K相互作用[7]。在分子水平上，它們能夠促進具有許多外顯子的長基因的轉錄，并參與mRNA選擇性剪接。在細胞水平，Cdk12和Cdk13能夠在胚胎干細胞中維持自我更新[8]。本研究深入探討了Cdk12和Cdk13異常對神經(jīng)元軸突伸長的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

C57BL/6小鼠以及載體構建購自廣州賽業(yè)科技生物公司。靶向敲除Cdk12和Cdk13小鼠均由廣州賽業(yè)科技生物公司合成?？剐∈驝dk13的寡核苷酸合成序列以及克隆到載體中已獲得pCdk13-s，pCdk-i2和pCdk13-i1，小鼠Cdk5激活劑，p53通過PCR擴增，所有構建體通過限制性內切酶測序。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染

P19細胞購自于武漢博士德生物技術公司，脂質體Lipofectamine3000購自Invitrogen公司。P19細胞于10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。轉染后，施用8 μg/mL嘌呤霉素7 h以選擇轉染的細胞。轉染后32 h，將培養(yǎng)基更換為含有1%血清的MEM。在轉染后80 h收獲細胞用于免疫細胞化學，RNA提取或蛋白質提取。轉染后48 h收獲細胞用于蛋白質提取。

1.3 免疫熒光和神經(jīng)軸突計數(shù)

將細胞用4%多聚甲醛固定15 min，并用37℃ PBS清洗，0.1% Triton X-100通透20 min，用合適的一抗封閉樣品，然后用熒光二抗山羊抗小鼠抗體避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察照相。封固前加入DAPI（1 μg/mL）避光孵育5 min。具有TuJ-1陽性信號的細胞被認為是分化的神經(jīng)元。軸突長度采用Image J軟件進行測量，采用最長的分支神經(jīng)突長度來代表細胞的神經(jīng)突向外生長。隨機選取10個高倍視野，每個視野內選取5個最長的軸突進行測量，長度單位為μm[9]。

1.4 蛋白質印跡分析

將轉染的細胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌一次，并溶于放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解緩沖液（20 mM HEPES，pH 7.8，150 mM NaCl，1mM EDTA，0.1%Triton X-100，50 mM NaF，1 mM二硫蘇糖醇）中和蛋白酶抑制劑雞尾酒）。通過兩次以14 000 rpm離心10 min清除細胞裂解物，并將上清液用于Western印跡分析。將等量的細胞裂解物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移至硝酸纖維素膜上。用5%脫脂奶封閉后，加入一抗4℃孵育過夜。洗滌膜并在室溫下與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗孵育1 h，用化學發(fā)光法將蛋白印跡曝光到膠片上。

1.5 RT-PCR測定

Tirzol法提取經(jīng)質粒轉染培養(yǎng)的至細胞培養(yǎng)第3天（DIV3）的神經(jīng)元RNA，用病毒進行反轉錄，使用Invitrogen公司的核酸提取試劑盒，擴增用的引物和探針序列由Invitrogen公司合成。PCR擴增引物由武漢博士德生物技術公司合成。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Cdk12和Cdk13在神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)中的表達

使用原位雜交和蛋白質印跡來檢測Cdk12和Cdk13在mRNA和蛋白質水平上的表達模式。Cdk12 mRNA存在于E6.5胚胎滋養(yǎng)細胞中，在E7～E7.5期間，Cdk12在所有細胞中表達，但在原條（PS）中表達更強。在E8.5和E9.5胚胎中，在前腦、中腦中檢測到更強的信號，Cdk13也普遍表達，但在所檢查的各種發(fā)展階段都沒有在心臟中表達。見封三圖4。

2.2 Cdk12或Cdk13對維持神經(jīng)軸突伸長的作用

在體外培養(yǎng)3 d后，在Cdk12和Cdk13耗盡的皮質神經(jīng)細胞中，軸突的平均長度減少[對照為（101.00±5.25）μm]，Cdk12耗盡細胞中軸突長度為（42.00±3.30）μm，Cdk13耗盡細胞中軸突長度為（41.00±2.05）μm（P<0.05）。見封三圖5。

2.3 Cdk5的表達受Cdk12和Cdk13的調控

發(fā)現(xiàn)Cdk12或Cdk13的敲減將Cdk5 mRNA水平降低至對照水平的約40%（圖1A），Cdk5蛋白表達也降低至對照組約50%（圖1B，C）（P<0.05），這表明Cdk12和Cdk13對Cdk5的調節(jié)主要作用在RNA水平。

3 討論

智力障礙嚴重危害社會生活，給家庭帶來災難，而缺氧引起的腦神經(jīng)損傷是引起智力障礙的重要原因。然而臨床上尚無特效的治療方法，因此尋求新的治療策略具有重要的科學意義。Cdk13是最晚發(fā)現(xiàn)的細胞周期依賴性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）家族成員，又名CDC2L5，普遍存在于人體組織中，目前研究比較少。其家族蛋白C端有一特殊結構，20個ATP依賴的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶結構，可通過整合細胞外和細胞內的信號，實現(xiàn)細胞內循環(huán)和基因轉錄過程的調控功能。Cdk12和Cdk13具有較多的重復同源序列，最近發(fā)現(xiàn)其可能在轉錄和RNA加工過程中發(fā)揮重要作用[10]。人類Cdk13蛋白分子量較大，為165 kDa，Cdk13、Cdk12與周期蛋白Cyclin K結合形成蛋白復合物發(fā)揮生物學功能[11]。Cdk13主要定位于細胞核，尤其集中在存儲RNA剪接因子的核斑。Cdk13除了C端具有ATP依賴的蛋白激酶用于磷酸化RNA多聚酶Ⅱ，促使基因的轉錄和RNA的延伸外，還有三個功能域，用于參與CDK13與目標蛋白的相互作用：一個是位于N端的包含200～435個氨基酸殘基的富絲氨酸-精氨酸（Serine-arginine Rich，SR）模體，此模體可促使Cdk13與SR蛋白家族成員相互作用，參與RNA加工和前提mRNA剪接的調控[12，13]。國外研究[14]同時報道Cdk13的錯義變異會導致運動和語言發(fā)育遲緩、智力障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)Cdk12和Cdk13有助于軸突生長，同時在Cdk12或Cdk13耗盡后，培養(yǎng)的P19細胞和原代皮質神經(jīng)元失去了將軸突延伸到更遠距離的能力，軸突受Cdk12和Cdk13影響的一種蛋白質是Cdk5，研究發(fā)現(xiàn)敲除Cdk12和Cdk13后Cdk5的mRNA含量降低，提示通過Cdk5調控軸突的伸長（圖3）。其還參與了許多類似的生物學過程[15]。CDK12敲除后的小鼠表現(xiàn)小頭畸形，通過DNA損傷影響神經(jīng)細胞的改變，增加了自發(fā)凋亡[16]。非功能性CDK13敲除小鼠可表現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損壞導致智力障礙[17]。Cdk12和Cdk13在維持小鼠胚胎干細胞的多能性方面發(fā)揮著不可或缺的作用[8]。Cdk12和Cdk13都參與RNA剪接調節(jié)[18]。Cdk12和Cdk13的表達發(fā)生在早期發(fā)育階段，比如在E6.5小鼠胚胎。Cdk12和Cdk13之間表達模式和功能的相似性詳見圖1。此外，Cdk13通過RNAPII的羧基末端結構域的Ser2的磷酸化參與蛋白質調節(jié)[19]。CDK13能介入翻譯和mRNA進程，從而在基因表達上發(fā)揮重要作用[20，21]。

最新研究[22]顯示，軸突結構異常與遺傳性智力低下的學習障礙相關，常見的是21三體導致的Down綜合征，表現(xiàn)為智力低下，特殊面容，伴有心臟異常等。Cdk12和Cdk13的敲除不影響3DIV的SMI312陽性皮質神經(jīng)元。這表明Cdk12和Cdk13都能夠調節(jié)軸突特異性微管組織，促進神經(jīng)元軸突伸長。然而，Cdk12和Cdk13產生這種差異效應的潛在機制仍不清楚。Cdk12和/（或）Cdk13的沉默也可能導致異常的微管重塑和軸突中微管動力學的變化。下游Cdk12和Cdk13底物蛋白是如何對軸突的長度變化具體機制仍需要進行更深入的研究。

[參考文獻]

[1] 張丹妍，馮雪菲，戴禮猛，等.應用多重連接依賴探針擴增和微陣列比較基因組雜交技術檢測不明原因智力障礙患兒[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（2）：11-12.

[2] 郭輝，劉富華，歐明林，等.智力障礙小家系中致病基因的研究[J]. 第三軍醫(yī)大學學報， 2016，38（8）：889-892.

[3] Altiner S，Yurur KN.Importance of patient selection criteria in determining diagnostic copy number variations in patients with multiple congenital anomaly/mental retardation[J]. Mol Cytogenet，2019，12：23.

[4] Hamilton MJ，Suri M. CDK13-related disorder[J]. Adv Genet，2019，103：163-182.

[5] van den Akker W，Brummelman I，Martis L M，et al. De novo variants in CDK13 associated with syndromic ID/DD： Molecular and clinical delineation of 15 individuals and a further review[J]. Clin Genet，2018，93（5）：1000-1007.

[6] Wang R，Lei T，F(xiàn)u F，et al. Application of chromosome microarray analysis in patients with unexplained developmental delay/intellectual disability in South China[J]. Pediatr Neonatol，2019，60（1）：35-42.

[7] Greenleaf AL.Human CDK12 and CDK13，multi-tasking CTD kinases for the new millenium[J].Transcription，2019， 10（2）：91-110.

[8] Dai Q，Lei T，Zhao C，et al. Cyclin K-containing kinase complexes maintain self-renewal in murine embryonic stem cells[J]. J Biol Chem，2012，287（30）：25344-25352.

[9] 陳甲，矯樹生，梁春榮，等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體對小鼠海馬神經(jīng)元存活和突起生長的抑制作用[J].解放軍醫(yī)學雜志，2014，39（9）：690-694.

[10] Malumbres M，Harlow E，Hunt T，et al. Cyclin-dependent kinases：A family portrait[J]. Nat Cell Biol，2009，11（11）：1275-1276.

[11] Greifenberg AK，Honig D，Pilarova K，et al. Structural and functional analysis of the Cdk13/Cyclin K complex[J].Cell Rep，2016，14（2）：320-331.

[12] Lipp JJ，Marvin MC，Shokat KM，et al.SR protein kinases promote splicing of nonconsensus introns[J]. Nat Struct Mol Biol，2015，22（8）：611-617.

[13] Wu HJ，Pu JL，Krafft PR，et al. The molecular mechanisms between autophagy and apoptosis：Potential role in central nervous system disorders[J]. Cell Mol Neurobiol，2015，35（1）：85-99.

[14] Trinh J，Kandaswamy KK，Werber M，et al. Novel patho-genic variants and multiple molecular diagnoses in neurodevelopmental disorders[J].J Neurodev Disord，2019，11（1）：11.

[15] Bosken CA，F(xiàn)arnung L，Hintermair C，et al.The structure and substrate specificity of human Cdk12/Cyclin K[J]. Nat Commun，2014，5：3505.

[16] Chen H，Juan H，Wong Y，et al. Cdk12 regulates neurogenesis and late-arising neuronal migration in the developing cerebral cortex[J]. Cerebral Cortex，2016，27（3）：2289-2302.

[17] Kohoutek J，Novakova M，Vrabel D，et al. Mouse model of congenital heart defects， dysmorphic facial features and intellectual developmental disorders as a result of nonfunctional CDK13[J].Frontiers in Cell and Developmental Biology，2019，7：155.

[18] Lei T，Zhang P，Zhang X，et al. Cyclin K regulates prereplicative complex assembly to promote mammalian cell proliferation[J]. Nat Commun， 2018，9（1）：1876.

[19] Ghamari A，van de Corput MP，Thongjuea S，et al.In vivo live imaging of RNA polymerase II transcription factories in primary cells[J].Genes Dev，2013，27（7）：767-777.

[20] 王晶，王芳，張瓊，等.大鼠發(fā)育過程中海馬星形膠質細胞與神經(jīng)元細胞周期蛋白依賴性激酶的表達差異[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2012，7（1）：13-18.

[21] 蔣世一，吳學潮，郭中葉，等.長鏈非編碼RNA SNHG12在腦膠質瘤中的表達及其功能研究[J].中華神經(jīng)外科雜志，2018，34（12）：1268-1273.

[22] Fan Y，Yin W，Hu B，et al.De novo mutations of CCNK cause a syndromic neurodevelopmental disorder with distinctive facial dysmorphism[J].Am J Hum Genet，2018， 103（3）：448-455.

（收稿日期：2019-07-03）