苦瓜中α-葡萄糖苷酶抑制劑的超濾質(zhì)譜篩選研究

郭力菲，侯萬超，趙婉伊，趙紅磊，?？〔渭?，孫鳴悅，何文麗，劉春明＊

（長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130032）

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種臨床常用的口服降糖藥物，它能夠抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，從而達(dá)到降低餐后高血糖的作用[1-2]。目前，從天然藥物或者植物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究已成為熱點(diǎn)。苦瓜（Momordica charantia）為葫蘆科苦瓜屬植物，其根、莖葉及果實(shí)皆可入藥，具有清熱解毒的作用[3]?？喙瞎麑?shí)也是一種經(jīng)常食用的蔬菜，很多文獻(xiàn)報(bào)道其化學(xué)成分具有很好的降血糖功效[4-6]。董義研究了6種保健食品原料的降糖效果，認(rèn)為苦瓜的降糖效果最好[7]。彭曉赟等[8]研究了苦瓜根總皂苷提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的作用，并得到α-葡萄糖苷酶抑制活性最好的皂苷提取工藝。劉慧娟等[9]研究了7種苦瓜皂苷單體化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，證明皂苷是苦瓜抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。從苦瓜提取物中篩選出有效的活性成分，不僅能了解其降糖機(jī)制，還能為尋找新的治療糖尿病藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

超濾質(zhì)譜技術(shù)是將超濾技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的一種藥物篩選方法[10-11]，主要是利用親和原理將含有潛在活性的小分子物質(zhì)與受體混合，形成復(fù)合物，通過超濾膜濾去未結(jié)合的小分子物質(zhì)，以有機(jī)溶劑處理釋放小分子配體，并采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行鑒別。該方法具有分析速度快、無需預(yù)處理過程等優(yōu)點(diǎn)，在藥物篩選過程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究選擇α-葡萄糖苷酶作為藥物靶點(diǎn)，利用離心超濾和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法，從苦瓜提取物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，并利用LC-MS技術(shù)對(duì)篩選出的活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Agillent 1260 Infinity型高效液相色譜儀，配備UV檢測(cè)器（Agillent，美國(guó)）；Q Extractive 質(zhì)譜儀（）hermo Scientific，美國(guó)）；3-30K高速冷凍離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）；G3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，德國(guó)）；THZ-D恒溫振蕩器（大倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；Integrel 3超純水儀（Millipore，美國(guó)）。

苦瓜片，購自中東萬家醫(yī)藥超市（長(zhǎng)春）；α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, 100U），購自美國(guó)sigma公司；YM-10型Microcon超濾管，購自美國(guó)Millipore公司；醋酸銨（分析純），購自天津科密歐試劑有限公司；乙腈（HPLC），購自美國(guó)Fisher公司；甲醇（分析純），購自北京化工廠；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore超純水。

1.2 樣品處理

取自然風(fēng)干的苦瓜片，用粉碎機(jī)粉碎過60目篩。準(zhǔn)確稱取10.0g苦瓜干粉，按料液比1∶10加甲醇回流提取1h，過濾后，濾渣進(jìn)行同樣條件的二次提取，將兩次提取的濾液合并濃縮至樣品濃度為0.5 g/mL，過0.45μm濾膜，待用。

1.3 離心超濾篩選方法

分別移取50 μL 0.5 g/mL苦瓜提取物溶液和25 μL 1.0 U α-葡萄糖苷酶溶液，加入925 μL pH=6.8的10 mmol/L 的醋酸溶液中，置于37 ℃恒溫振蕩器中反應(yīng)40 min，移取800 μL至截留分子量為10000的YM-10型超濾管中，于14000 r/min下超速離心30 min，向?yàn)V膜中加入100 μL 10 mmol/L的醋酸溶液（pH=6.8），離心清洗3次，洗去未結(jié)合成分。再向?yàn)V膜中加入100 μL甲醇（pH=3.3），在14000r/min下離心30min釋放結(jié)合配體，重復(fù)2次，收集洗脫液，用于LC-MS分析。不加α-葡萄糖苷酶的空白實(shí)驗(yàn)處理方法同上。

1.4 LC-MS分析條件

色譜柱：5μm, 250mm×4.6mm；流動(dòng)相：乙腈-水梯度洗脫（0min，40%乙腈；2min，60%乙腈；40min，100%乙腈；50min，100%乙腈）。流速：0.8mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；噴霧電壓：3.3kV；鞘氣流速：40psi（1 psi≈6.9 kPa）；輔助氣流速：10 psi；毛細(xì)管溫度320℃；輔助氣溫度320 ℃；S-Lens分辨率：50；掃描范圍：m/z150～2000Da；質(zhì)量分辨率：70000。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦瓜化學(xué)成分與α-葡萄糖苷酶生物親和作用研究

苦瓜提取物與α-葡萄糖苷酶作用和與不加α-葡萄糖苷酶的空白實(shí)驗(yàn)的高效液相色譜圖如圖1所示。當(dāng)苦瓜提取物中的化學(xué)成分與α-葡萄糖苷酶發(fā)生特異結(jié)合后，α-葡萄糖苷酶捕獲的配體所對(duì)應(yīng)的峰面積均大于其空白對(duì)照。圖1表明，苦瓜提取物中有5個(gè)化學(xué)成分與α-葡萄糖苷酶結(jié)合。

通過分別對(duì)比5個(gè)化合物在兩種不同實(shí)驗(yàn)條件下的液相色譜圖1a和圖1b，考察化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在控制變量保證其它實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，該5個(gè)化合物與α-葡萄糖苷酶作用和與不加α-葡萄糖苷酶的空白實(shí)驗(yàn)的液相色譜比值明顯較大。因此由圖1a和圖1b可推測(cè)該5個(gè)化合物與α-葡萄糖苷酶具有結(jié)合作用，可以抑制α-葡萄糖苷酶生物活性，具有潛在的2型糖尿病活性。

圖1 苦瓜提取物的離心超濾HPLC圖(a-與α-葡萄糖苷酶作用、b-空白試驗(yàn))

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析和結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)超濾親和篩選出的5種化合物的保留時(shí)間和特征離子峰（表1），結(jié)合參考文獻(xiàn)進(jìn)行解析，結(jié)果見圖2。

化合物1（tR25.86 min）的ESI-MS圖譜顯示，m/z 687.38[M+K]+，m/z 671.32[M+Na]+，由此判斷該化合物的相對(duì)分子量為648。苦瓜皂苷K的分子式為C37H60O9，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量為648，與此質(zhì)譜信息吻合。圖譜中還顯示m/z 666.46[M+H2O]+,m/z 437[M+H-162-H2O-CO2]，其中162代表失去一個(gè)葡萄糖基，進(jìn)一步確定了該化合物的結(jié)構(gòu)[9]。

化合物2（tR31.56min）的ESI-MS圖譜顯示，m/z 511.32[M+K]+, m/z 495.34[M+Na]+，由此判斷該化合物的相對(duì)分子量為472?？喙纤豂的分子式為C30H48O4，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量為472，與此質(zhì)譜信息吻合。圖譜中還顯示m/z 437.34[M+H-2H20]+，m/z 419.33[M+H-3H2O]+進(jìn)一步確定了該化合物的結(jié)構(gòu)[12]。

化合物3（tR32.98min）ESI-MS圖譜顯示，m/z 671.39[M+K]+, m/z 655.34[M+Na]+, 633.44[M+H]+，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量為632。苦瓜皂苷G的分子式為C37H60O8，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量為632，與此質(zhì)譜信息吻合。圖譜中還顯示m/z 471.38[M+H-162]+，m/z 439.36[M+H-162-CO2]+，進(jìn)一步確定了該化合物的結(jié)構(gòu)[6]。

化合物4（tR34.50min）ESI-MS圖譜顯示，m/z 701.40[M+K]+，m/z 685.43[M+Na]+，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量為632。未能找到與之對(duì)應(yīng)的化合物。

化合物5（tR35.88min）ESI-MS圖譜顯示，m/z 525.33[M+K]+，m/z 509.36[M+Na]+，m/z 633.44[M+H]+，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量為486。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β, 23-diol和 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol的分子式為C31H50O4，理論分子質(zhì)量為486，與此質(zhì)譜信息吻合[13]。

表1 苦瓜提取物中的活性成分鑒定

3 結(jié)論

通過超濾-質(zhì)譜方法從苦瓜提取物中篩選出5種具有潛在α-葡萄糖苷酶抑制活性的化學(xué)成分，其中4種經(jīng)初步鑒定為苦瓜皂苷K、苦瓜素I、苦瓜皂苷G、(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol或 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol），1種暫未確定其結(jié)構(gòu)。本研究為進(jìn)一步開發(fā)基于苦瓜的降糖產(chǎn)品提供了依據(jù)。

圖2 化合物1～5的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

（a、b、c、d、e依次為苦瓜皂苷K、苦瓜素I、苦瓜皂苷G、未知、(19R)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β, 23-diol或 (19S)-5β,19-epoxy-19-methoxycucurbita-6,24-dien-3β,23-diol）