木薯朱砂葉螨抗阿維菌素品系選育及其解毒酶活性變化

劉連軍， 黎 萍， 李恒銳， 楊海霞， 農秋連， 梁振華， 馬仙花

(廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所，廣西崇左 532415)

朱砂葉螨[Tetranychuscinnabarinus(Boisduval)]屬葉螨科(Tetranychidae)，別稱紅蜘蛛，是危害木薯最為嚴重的一種害螨，可導致當地木薯減產10%～30%，嚴重危害時可減產 50%～70%[1]。朱砂葉螨個體小、繁殖能力強、世代周期短，年繁殖代數可達15代。由于生產上長期大面積使用化學農藥防治朱砂葉螨，不可避免地會產生抗藥性[2-3]。

阿維菌素是一種廣譜、高效、低殘留，對人畜安全的抗生素類殺蟲劑[4-5]，以干擾害蟲神經來殺死害蟲，與常用殺蟲劑的作用機制不同，不會和常用殺蟲劑產生交互抗性，適合防治對其他殺螨劑已產生抗藥性的害蟲。用阿維菌素進行螨類抗性選育已有報道，如陳文博等研究表明，土耳其斯坦葉螨對阿維菌素的抗性發(fā)展較慢[6]；劉貽聰等研究得出，二斑葉螨田間種群普遍對阿維菌素產生了穩(wěn)定抗性[7]；宋麗雯等用阿維菌素對截形葉螨進行抗性篩選，結果表明截形葉螨對阿維菌素抗性較穩(wěn)定[8]。

螨類抗藥性形成與體內各種解毒酶系活性變化存在密切聯系[9]。研究認為，多功能氧化酶(MFO)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)等是動物體內的重要解毒酶系[10]。MFO的底物譜極廣，幾乎能氧化代謝所有殺蟲劑，與許多害蟲的抗藥性形成有關；GSTs能使內源谷胱甘肽與化學農藥(包括殺蟲劑、殺螨劑)中具有毒理作用的親電基團結合并排出體外；CarE是昆蟲體內重要的解毒酶系，在對外源化合物的解毒代謝和對殺蟲劑的抗性形成中起重要作用。何林等報道用阿維菌素處理不同螨類其結果都表明該抗性品系的形成與體內解毒酶活性升高有一定關系[9，11-12]，但尚未見對木薯朱砂葉螨抗藥性機制方面的報道。本研究采用室內噴藥繼代汰選法對阿維菌素進行木薯朱砂葉螨抗性篩選，分析敏感品系和抗性品系3種解毒酶活性的變化，旨在探討朱砂葉螨對阿維菌素抗性形成及其體內解毒酶活性變化與產生抗性之間的關系，為朱砂葉螨的抗性綜合治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點和時間

試驗地點設在廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所農產品檢測中心，2016年4—12月進行室內抗性品系篩選，2017年1月進行解毒酶活性測定。

1.2 供試蟲源

朱砂葉螨敏感品系(SS)：供試木薯朱砂葉螨采自廣西南亞熱帶農業(yè)科學研究所木薯種植田間，試驗前在室內飼養(yǎng)繁殖至少2代。飼養(yǎng)溫度為(27±2) ℃，相對濕度為(75±2)%，光照16 h/d，期間不接觸任何藥劑。

朱砂葉螨抗性品系(Ab-R)：從朱砂葉螨敏感品系中分離部分群體，擴繁后用阿維菌素乳油進行抗性篩選，采用水隔式飼養(yǎng)法(木薯葉葉背朝上置于托盤內的浸濕海綿上)連續(xù)飼養(yǎng)至15代，可視為抗性品系。

1.3 供試藥劑和主要儀器

阿維菌素乳油(購自廣東中迅農科股份有限公司)；α-萘酚(購自國藥集團化學試劑有限公司)，分析純；固藍B鹽(購自成都艾科達化學試劑有限公司)，分析純；4-對硝基苯甲醚(購自成都艾科達化學試劑有限公司)，分析純；十二烷基磺酸鈉(SDS，購自北京欣華綠源科技有限公司)，化學純；α-乙酸萘酯(購自上海瑞永生物科技有限公司)，化學純；毒扁豆堿(a-NA，購自Fluka公司)，純度≥98%；2，4-二氯硝基苯(DCNB，購自Sigma公司)，純度>98%，化學純；還原型谷胱甘肽(購自Japan公司)，純度≥98%；牛血清白蛋白(購自北京欣華綠源科技有限公司)；考馬斯亮藍G-250(購自Fluka公司)；乙二胺四乙酸(EDTA，購自上海源葉生物科技有限公司)；還原型輔酶Ⅱ(NADPH，購自Sigma公司)，純度≥98%。人工氣候培養(yǎng)箱(型號LRH-250-GsbI，購自韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；T6新世紀紫外分光光度計(購自北京普析通用儀器有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 抗性品系選育 參照黎萍等的方法[13]，用1.8%阿維菌素乳油，以種群死亡率25%左右的選擇壓力給予噴藥處理，噴藥24 h后將存活的葉螨個體轉移到托盤里離體新鮮的木薯葉背面，采用水隔式培養(yǎng)，待存活個體在新鮮木薯葉上產卵3 d后移走，每次噴藥后進行生物測定，計算致死中濃度，適當提高每代噴藥濃度。當F1代成螨高峰期時再次噴藥處理，重復上述操作，直至F15代。

1.4.2 室內毒力測定 參照黎萍等的方法[13]，每代分別設置5種不同梯度的藥劑濃度，每個梯度濃度保證螨死亡率在40%～75%，每個濃度重復3次，用清水作為對照。取飼養(yǎng)室個體大小均勻一致的雌成螨接于新鮮離體的木薯葉背面，作為F0代成螨。用手持式噴霧器均勻噴施于木薯葉背面，24 h 后檢查死亡率，挑選存活成螨置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為(27±2) ℃，相對濕度為(75±2)%左右，光照 16 h/d。每次施藥后記錄施藥前成螨總數和施藥后死亡數，計算抗性指數。

抗性指數=抗性品系LC50/敏感品系LC50。

1.4.3 解毒酶活性測定

1.4.3.1 酶液制備 挑取木薯朱砂葉螨敏感品系和經致死量處理過100頭左右的雌性朱砂葉螨，加入2 mL相對應的磷酸緩沖液(0.1 mol/L、pH值為7.0)，冰浴中研磨充分，在高速離心機中離心(10 000 r/min、4 ℃)15 min，取上清液，置于冰浴中待用，上清液即為酶液。

1.4.3.2 蛋白質標準曲線繪制 取7支試管按表1順序加入試劑，在37 ℃恒溫水浴內放置10 min，在595 nm下比色測定(表1)。以牛血清蛋白含量(μg/mL)為橫坐標，并以測得的吸光度取平均值后為縱坐標，繪制標準曲線。

表1 蛋白質標準曲線測定

1.4.3.3 CarE活性測定 參照van Asperen的方法[14]，以 a-NA (3×10-4mol/L，含10-4mol/L a-NA)為底物，加 3 mL 酶液，混勻，在30 ℃恒溫水浴10 min，立刻加0.5 mL顯色劑，在30 ℃水浴反應10 min，待顏色穩(wěn)定后，在紫外分光光度儀上600 nm處測定吸光度，3次重復。根據酶源蛋白質含量的測定結果計算CarE的比活力[mmol/(mg·30 min)]。

1.4.3.4 GSTs活性測定 參照Clark等的方法[15]，取 66 mmol/L pH值為7.0的磷酸緩沖液、50 mmol/L谷胱甘肽、0.03 mol/L 2，4-二硝基苯和酶液分別為2.4、0.3、0.1、0.2 mL，對照不加酶液，混合均勻，27 ℃水浴10 min，在紫外分光光度儀上340 nm處測定吸光度，重復3次。根據酶源蛋白質含量測定結果，將吸光度換算成比活力[ΔD/(mg·30 min)]。

1.4.3.5 MFO活性測定 取對硝基苯甲醚(0.1 mol/L、pH值為7.0)、磷酸緩沖液、NADPH和酶液分別為0.1、1.9、0.5、0.5 mL，對照不加酶液，混合搖勻，置于37 ℃水浴振蕩 30 min，然后加1.0 mL HCl溶液(1 mol/L)終止反應，后用四氯甲烷、NaOH溶液(0.5 mol/L)萃取，在溫室下靜置10 min后，取 2.0 mL 水相置于比色皿中，在400 nm處測吸光度。根據各處理的吸光度與標準曲線相比較，計算MFO的比活力[nmol/(mg·30 min)]。

1.4.3.6 數據統(tǒng)計與分析 阿維菌素對朱砂葉螨的抗性選育結果數據及解毒酶活性數據處理均采用SPSS Statistics 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 木薯朱砂葉螨對阿維菌素抗性的選育

朱砂葉螨對阿維菌素抗性結果(表2)表明，通過從F1至F15代試蟲的逐次汰選和飼養(yǎng)，獲得F15代抗性倍數為3.25。LC50由2.830 μg/mL上升到9.208 μg/mL，F0～F6、F7～F12、F13～F15抗性倍數范圍分別在1.00～1.87、2.01～2.84、3.03～3.25內。由此可見，阿素菌素對朱砂葉螨的抗藥倍數呈緩慢上升趨勢，抗性發(fā)展較慢，沒有出現抗性突增階段。

2.2 朱砂葉螨不同品系對CarE比活力的變化

由表3可知，與SS品系相比只有Ab-R15品系CarE比活力達到顯著性差異水平，為SS品系的1.27倍。除了Ab-R15品系外，其余2個抗性品系與SS品系CarE比活力差異均未達到顯著水平，說明阿維菌素抗性品系的形成與CarE比活力可能關系不大。

2.3 朱砂葉螨不同品系對GSTs比活力的變化

由表4可知，連續(xù)15代篩選，GSTs的比活力一直在上升中，Ab-R5品系比活力上升幅度最小，與SS品系之間沒有顯著性差異，篩選至10代，Ab-R10品系比活力上升較快，與 Ab-R5、SS品系之間差異達到顯著水平，為SS品系的1.43倍，說明朱砂葉螨對阿維菌素抗性水平的提高可能部分與GSTs比活力的提高有關。

2.4 朱砂葉螨不同品系對MFO比活力的變化

由表5可知，隨著選育代數的增加，MFO的比活力不斷增強，且上升幅度相對較大，Ab-R品系與SS品系之間MFO比活力差異均達到顯著性水平，Ab-R15品系是SS品系的1.92倍，從F5代到F15代MFO的活性上升較快，且與SS品系相比具有顯著差異，表明朱砂葉螨對阿維菌素產生的抗性與MFO比活力增強有直接關系， 而且是朱砂葉螨對阿維菌素產生抗藥性的重要原因。

表2 木薯朱砂葉螨抗阿維菌素品系選育結果

表3 朱砂葉螨不同品系對CarE比活力的變化

注：表中所示數據為平均值±標準差；同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

表4 朱砂葉螨不同品系對GSTs比活力的變化

表5 朱砂葉螨不同品系對MFO比活力的變化

3 結論與討論

通過阿維菌素對木薯朱砂葉螨的室內篩選，獲得F15代抗性為3.25倍的朱砂葉螨阿維菌素種群，在抗性篩選過程中發(fā)現該朱砂葉螨對阿維菌素的抗性發(fā)展速度慢，呈平緩的上升趨勢，沒有出現抗性突增階段，不易產生抗藥性，這與陳文博等的研究結果[6，8]一致。

室內抗性選育是害蟲抗藥性研究的重要手段，抗藥性發(fā)展的速度和程度與害蟲種類、原始種群的抗性水平、藥劑種類及選擇壓力有關[16]。通過朱砂葉螨對阿維菌素的抗藥性研究結果表明，在實際生產中為預防朱砂葉螨對阿維菌素過快產生抗藥性，要適當與常用藥劑進行輪換或者選用混配藥劑，控制使用量和施用次數，從而延長阿維菌素的使用壽命，這樣才有可能阻止或延緩害螨抗藥性的發(fā)生。

本研究用阿維菌素經F15代抗性選育后，對Ab-R品系和SS品系的3種解毒酶(CarE、GSTs和MFO)比活力測定表明，CarE比活力在F10代前基本沒有變化，Ab-R品系與SS品系之間的比活力差異不顯著；GSTs選育F10代時比活力變化顯著，Ab-R10品系比SS品系比活力提高1.43倍；MFO的比活力變化顯著且上升較快，說明朱砂葉螨體內MFO在對阿維菌素的抗藥性中起主要作用，這與沈一凡等認為MFO比活力增強是二斑葉螨對阿維菌素產生抗藥性的主要原因的結論[11-12]相印證。高新菊等報道二斑葉螨對四螨嗪產生抗性是3種解毒酶協(xié)同作用的結果[17]；劉金香等研究表明，水胺硫磷和甲氰菊酯的抗性形成與3種解毒酶有一定的關系[18]。同樣，筆者認為木薯朱砂葉螨對阿維菌素抗性的形成與CarE、GSTs、MFO比活力的變化存在聯系，但MFO比活力的提高是導致朱砂葉螨抗性形成的重要原因。

本研究的木薯朱砂葉螨室內抗性選育至F15代，如果抗性篩選不斷進行，朱砂葉螨抗性會迅速上升。隨著抗性的增強，朱砂葉螨體內3種解毒酶活性可能會有更大的變化，因此本課題有待今后繼續(xù)深入探討，為進一步研究抗性治理提供科學的理論依據。