黃花蒿水浸液對赤豆種子萌發(fā)及幼苗生長的化感效應(yīng)

張曲玲， 楊占南， 羅世瓊， 霍鴻浩， 趙 鋮， 扶 蝶， 楊 娟

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001； 2.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽 550001；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽 550001)

黃花蒿(ArtemisiaannuaL.)廣泛分布于我國及世界各地，是傳統(tǒng)的藥用植物，富含萜類、酚類、類黃酮及其他代謝物，民間用于治療多種疾病，如抗瘧疾、抗炎、止血等[1-3]。研究顯示，黃花蒿還具有其他藥效功能，如具有抗癌細胞活性[4]以及抑制艾滋病毒的作用[5]。黃花蒿是青蒿素的唯一原料來源，因此，我國特別是西南部重慶等地將黃花蒿作為重要的主要經(jīng)濟作物[6-7]。但因為它對環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性，且耐貧瘠，往往是裸露新地的先鋒植物[8]，大面積栽培或大量聚集生長會對周圍植物或當季及后茬作物產(chǎn)生化感效應(yīng)[9-12]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)受黃花蒿化感影響的植物有燕麥、小麥、蒲公英、黃瓜、蘿卜[13]、豇豆、菜豆、白菜、大白菜[9]、灰菜、玉米、豌豆[14]、綠豆[15]、綠藻[16]等。但鮮見黃花蒿對赤豆化感作用的報道。

赤豆[Vignaangularis(Willd.) Ohwi et Ohash]別稱小豆或赤小豆，含有蛋白質(zhì)、糖類、粗纖維、鈣、磷等營養(yǎng)成分，是一種很受歡迎的大眾食品[17]。赤豆植株成直立或纏繞草本生長，花期在夏季，每年的9月—10月結(jié)果，全國均有栽種，西南地區(qū)往往種植于田邊和地邊，且與黃花蒿是同季作物[18]。而黃花蒿是一種強侵染性植物，喜長于田間地頭，可能對其周圍赤豆種子萌發(fā)及生長造成影響[1]。因此，研究黃花蒿對赤豆化感效應(yīng)具有重要意義。本研究以赤豆為受試對象，通過室內(nèi)培養(yǎng)，研究各部位不同濃度黃花蒿水浸液(aqueous extracts from Aremisia annus. L，簡稱AEA)對赤豆種子萌發(fā)、幼苗生長、保護酶活性、丙二醛和葉綠素含量的化感效應(yīng)，為明確黃花蒿對赤豆生長的機制及制定有效防范措施提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試赤豆于2017年7月6日購買于貴州省貴陽市萬東橋農(nóng)貿(mào)市場。供試黃花蒿于2016年8月26日采集于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)周邊山坡上，洗凈根部，將根、莖、葉分開，自然風干，經(jīng)粉碎，過100目篩，分別裝入樣品袋備用。于2017年10月在貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室進行化感效應(yīng)試驗。

1.2 水浸液的制備

稱取備好的黃花蒿粉末10 g，置于裝有100 mL去離子水的250 mL三角瓶中，在轉(zhuǎn)速為141 r/min，溫度為25 ℃的振蕩器中浸泡24 h。取出后，4 000 r/min離心10 min，取上清液得含有原料濃度為100 mg/mL的AEA，放入4 ℃冰箱中保存。使用前取出，并用去離子水配制成0(CK)、10、20、30、40 mg/mL 的濃度。

1.3 試驗處理

選取顆粒飽滿、大小一致的赤豆種子，用1.0%過氧化氫溶液(H2O2)消毒1 min，無菌去離子水洗凈。分別置于鋪有雙層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿均勻放置30粒消毒處理的赤豆，再加入10 mL各濃度AEA，各部位AEA的每個濃度設(shè)3個重復(fù)，以等量的去離子水為對照(即濃度 0 mg/mL，CK)，共42個重復(fù)。加蓋并在25 ℃暗培養(yǎng)，第3天記錄最終發(fā)芽數(shù)，幼苗持續(xù)培養(yǎng)15 d，自然光照，赤豆生長情況見圖1。

1.4 測定指標及方法

以芽長超過種子的1/2為標準記錄種子是否萌發(fā)，且以萌發(fā)的種子能生長成幼苗，計算赤豆種子的萌發(fā)率。在赤豆幼苗培養(yǎng)結(jié)束時，測量幼苗的莖長，單位是cm；稱10株長勢均勻幼苗的鮮質(zhì)量，單位是g/10株；并分析幼苗葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性，過氧化物酶(POD)活性，丙二醛(MDA)含量及葉綠素含量。SOD、POD活性及MDA含量分別采用愈創(chuàng)木酚、氮藍四唑和硫代巴比妥酸比色法測定；葉綠素含量使用分光光度法測定[19]

1.5 數(shù)據(jù)處理

赤豆種子萌發(fā)率=(萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；赤豆種子萌發(fā)抑制率=[(對照種子萌發(fā)率-處理種子萌發(fā)率)/對照種子萌發(fā)率]×100%。參照Williamson的方法[20]計算AEA的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)。即：RI=1-C/T；式中，C為對照值，T為處理值；RI>0為促進作用，RI<0為抑制作用，負值越小或負值的絕對值越大，化感效應(yīng)越強。通過此公式，可以計算出黃花蒿水浸葉對赤豆幼苗莖長和鮮質(zhì)量的RI。用Excel進行試驗數(shù)據(jù)基礎(chǔ)統(tǒng)計和作圖；采用SPSS 10.0軟件進行標準誤差分析、單因素方差分析和LSD法(最小顯著性差異法)作顯著性檢驗，顯著水平為P﹤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEA對赤豆萌發(fā)的影響

由圖2可知，AEA對赤豆萌發(fā)的影響具有來源(根、莖、葉)和濃度差異。與對照相比，除根AEA處理濃度為 10 mg/mL 時，赤豆種子的萌發(fā)率略有提高外，其他各處理均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強。10 mg/mL根、莖、葉AEA處理種子，赤豆的萌發(fā)率分別為95.71%、87.62%、81.90%；40 mg/mL根、莖、葉AEA處理種子的萌發(fā)率分別為87.62%、80.00%、73.33%。各部位AEA對赤豆種子萌發(fā)抑制作用強弱依次為根<莖<葉，10 mg/mL根、莖、葉AEA對赤豆萌發(fā)抑制率分別為-0.75%、7.77%、13.78%；40 mg/mL根、莖、葉AEA處理的萌發(fā)抑制率分別為7.77%、15.79%、22.81%。

2.2 AEA對赤豆幼苗生長的影響

圖3為AEA對赤豆幼苗生長情況的影響，葉AEA處理后的赤豆幼苗植株明顯矮化，幼苗葉片和根系畸形。各部位不同濃度處理的幼苗，培養(yǎng)期間莖長和鮮質(zhì)量表現(xiàn)出相似的趨勢。根AEA對赤豆幼苗的生長影響不大，濃度為 10 mg/mL 時，對幼苗莖長和鮮質(zhì)量還有一定的促進作用，與對照相比，幼苗莖長和鮮質(zhì)量分別增加3.94 cm、0.70 g/10株，濃度20～40 mg/mL AEA處理的幼苗生長狀況平穩(wěn)，影響不大。莖AEA處理后的幼苗，隨處理濃度增加，莖長和鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)緩慢減小的趨勢。但葉AEA對赤豆幼苗的影響更明顯，隨處理濃度增加，幼苗的莖長和鮮質(zhì)量均表現(xiàn)出明顯下降的趨勢，與對照相比，10、20、30、40 mg/mL葉AEA處理的幼苗莖長分別降低29.46%、38.13%、48.07%、68.25%，鮮質(zhì)量分別下降20.08%、27.37%、48.57%、68.67%。值得注意的是，AEA對赤豆幼苗生長的影響因水浸液來源黃花蒿部位的不同而異，與萌發(fā)率相似，影響強弱趨勢為根<莖<葉。處理濃度達40 mg/mL時，幼苗莖長分別為 22.12、17.02、7.22 cm；鮮質(zhì)量分別為3.26、3.06、1.85 g/10株?？梢婞S花蒿對赤豆幼苗生長有抑制作用的化感成分主要存在于葉片。

利用赤豆幼苗的莖長和鮮質(zhì)量進行分析，得到不同濃度AEA的IR。由表1可知，黃花蒿不同部位、不同濃度AEA，除濃度為10、20 mg/mL根AEA對幼苗的生長具有促進作用外，其他各AEA處理濃度均有不同程度的抑制效應(yīng)，且隨AEA濃度增加，IR值越小，說明對赤豆幼苗的化感效應(yīng)增強。各部位AEA處理濃度，除根30和40 mg/mL處理的莖長RI、根和莖20和30 mg/mL處理的鮮質(zhì)量RI之間不顯著以外，其余各濃度之間差異均顯著。但赤豆幼苗對不同部位AEA化感效應(yīng)的響應(yīng)不同，從綜合效應(yīng)指數(shù)來看，表現(xiàn)為根AEA化感作用較小，其次是莖，最大為葉片。

表1 AEA對赤豆幼苗生長的化感效應(yīng)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 AEA對赤豆幼苗生理生化指標的影響

2.3.1 AEA對保護酶活性的影響 由圖4可知，黃花蒿各部位AEA隨濃度升高，SOD活性降低，但降低的幅度不盡相同，根和莖AEA各濃度處理降低的幅度小，葉AEA各濃度處理降低的幅度大，與對照相比，10、20、40 mg/mL根、莖、葉AEA處理下的SOD分別降低0.76、1.51、1.87、2.11 U/g(根)；1.81、2.33、3.32、3.30 U/g(莖)；6.13、7.48、7.86、8.88 U/g(葉)。根AEA除了40 mg/mL的SOD活性顯著低于對照外，其他各處理濃度之間沒有顯著性差異；莖部AEA除了10 mg/mL處理的SOD活性與對照沒有顯著性差異外，其他3個濃度都顯著低于對照，且它們之間沒有顯著性差異；葉片AEA各處理濃度之間，除了20和 30 mg/mL 外，均差異顯著。與SOD活性相反，POD活性除根AEA處理濃度為 10 mg/mL 時比對照顯著下降外，總體隨著處理濃度的升高而增大。但增加的幅度各有差異，根10、20、30 mg/mL的AEA與對照相比無顯著性增加，當升高到40 mg/mL時，POD活性顯著大幅度增加； 莖部AEA各濃度， 除了10 mg/mL的AEA與對照的POD活性無顯著性增加外，其余各濃度均顯著提高；葉片各濃度AEA處理下的POD活性均顯著高于對照，說明葉片在低濃度時均會對POD活性造成負面影響。

2.3.2 AEA對赤豆幼苗MDA及葉綠素含量的影響 由圖5可看出，MDA含量隨著AEA濃度增加而升高。葉片AEA對MDA的累積促進作用最強，當濃度為40 mg/mL時，MDA含量最高，為7.69 mmol/g，是對照的2.30倍；其次是莖部AEA處理，與葉片AEA處理的MDA含量差異大，與根部AEA差異小，40 mg/mL時，MDA含量為4.91 mmol/g，為對照的1.46倍。根AEA對MDA含量的影響最弱，位于折線圖的最下方，各濃度與對照的差異不大，AEA濃度為 40 mg/mL 時，MDA含量最高，為對照的1.15倍。

AEA對赤豆幼苗總?cè)~綠素含量的影響因來源部位不同而異，葉片AEA濃度在10、20 mg/mL時葉綠素含量升高，分別比對照顯著提高15.30%、13.55%；30、40 mg/mL時葉綠素含量降低，與對照無顯著性差異。莖部AEA處理的幼苗，葉綠素含量變化不大，但總體高于葉片，并且都顯著高于對照，10、20、30、40 mg/mL莖部AEA分別比對照提高 19.26%、16.67%、23.54%、14.58%。根AEA處理濃度在10、20 mg/mL 時葉綠素含量比對照分別降低3.20%、8.88%，30、40 mg/mL 時葉綠素含量分別顯著升高10.88%、20.36%，在 40 mg/mL 時葉綠素含量最高，為10.04 mg/g。

3 結(jié)論與討論

植物界普遍存在化感效應(yīng)，其化感成分會抑制周圍其他植物的生長，利于擴大自身的競爭優(yōu)勢[21]。白三葉水浸液影響無芒稗種子萌發(fā)和幼苗生長[22]，黃連須根浸提液降低萵苣、綠豆和白菜種子的活力指數(shù)，并顯著降低這些植物幼苗的生物量和根系活力[23]。黃花蒿在生長過程中，不僅影響植物的生長，還影響其土壤微生物和動物的生長繁殖[14]。近期趙鋮等報道了AEA對同季作物綠豆種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用[15]，本研究探討了AEA對赤豆種子萌發(fā)及幼苗生長的化感效應(yīng)。結(jié)果顯示，黃花蒿各部位不同濃度AEA對赤豆種子萌發(fā)的化感作用，除了根AEA為10 mg/mL時具有促進作用外，其余各濃度均表現(xiàn)不同程度的抑制作用，且具有隨處理濃度升高而增強的效應(yīng)，各部位對赤豆種子萌發(fā)的抑制強弱表現(xiàn)為葉>莖>根，與前期對綠豆種子萌發(fā)結(jié)果[16]相似，張志忠等在空心蓮子草對生菜和蘿卜的化感作用研究中也得出相似的結(jié)果[24]。

AEA還影響赤豆幼苗生長，且也表現(xiàn)出濃度效應(yīng)，尤其葉片AEA對赤豆幼苗影響最為明顯，隨處理濃度增加，生長高度和健康狀況逐步減弱(圖1、圖2、圖3)，當葉片AEA濃度為40 mg/mL，對赤豆幼苗莖長和鮮質(zhì)量RI值最低，分別為 -4.109、-3.764(表1)，說明對赤豆幼苗生長的抑制化感效應(yīng)最強，該結(jié)果與以往的研究結(jié)果相似[22]，同樣，再力花地下部分水浸液對水生植物生長也具有抑制作用[25]。

植物在生長發(fā)育的過程中，形成自身體內(nèi)的保護套系統(tǒng)，這套系統(tǒng)一般是由POD、SOD等酶組成，其作用是避免細胞膜受到膜脂過氧化造成的傷害、維持細胞內(nèi)自由基的動態(tài)平衡[17]。POD是一種適應(yīng)性酶，植物對外界環(huán)境變化適應(yīng)和植物生長發(fā)育與體內(nèi)代謝變化都與POD活性密切相關(guān)[18]。本研究中POD活性隨浸提液濃度升高而增強，其原因可能是外界環(huán)境導(dǎo)致赤豆幼苗中活性氧、自由基增多，因此植物自身須要產(chǎn)生更多的POD來消除自由基。SOD也是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[19]。但SOD活性隨浸提液濃度升高反而呈下降趨勢，其可能原因是浸提液對赤豆幼苗的影響超過SOD調(diào)節(jié)的閥值，對植物造成傷害，導(dǎo)致SOD活性降低，還可能是酚類物質(zhì)對POD、SOD有影響，劉建國在對棉花的研究中發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)對POD活性具有促進作用[26]，但隨著酚類物質(zhì)濃度升高，對SOD活性的抑制越明顯[20]。

AEA對赤豆幼苗丙二醛含量的影響為隨處理濃度升高，丙二醛含量增多，這與鄭世英等在玉米中的結(jié)果[27]一致。其原因是植物在逆境環(huán)境中受到傷害就會產(chǎn)生MDA，且傷害越大，MDA含量越多[23]。然而，在本研究中，各部位不同濃度AEA處理下赤豆幼苗葉綠素含量變化沒有明顯規(guī)律，但除根AEA濃度為10和20 mg/mL處理的赤豆幼苗葉片葉綠素含量有所降低外，其他各濃度處理葉綠素含量均表現(xiàn)出與對照相當或顯著高于對照。黃花蒿對植物幼苗葉綠素含量的影響，因受試對象不同而有差異，如其化感物質(zhì)-青蒿素對豇豆(VignasinensisL.)和菜豆(PhaseolusvulgarisL.)幼苗的葉綠素含量有促進作用，對小白菜(Brassicachinensis)和大白菜(Brassicapikenensis)幼苗葉綠素含量有抑制作用[9]，本研究結(jié)果與前2種豆類相似，具體原因有待進一步研究。

總之，AEA抑制赤豆種子的萌發(fā)和幼苗的生長，并表現(xiàn)出明顯的來源部位(根、莖、葉)差異和濃度效應(yīng)，通過影響幼苗的生理活性，從而導(dǎo)致幼苗的不健康生長。