辣椒及土壤中咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺的殘留及消解動態(tài)研究

蔣夢云，鞏文雯，劉慶菊，胡 彬，張婷婷 ，韓 平

（1.北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心，北京 100097；2.北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029；3.北京市植物保護(hù)站，北京 100029）

辣椒味道鮮美、色澤光鮮，深受消費者喜歡。它既可食用，又具觀賞性，是盆栽種植的良好品種，但在盆栽種植過程中經(jīng)常會發(fā)生蚜蟲、白粉虱、根腐病等病蟲害，科學(xué)防治非常重要。在害蟲防治中，噴霧法是最常用的施藥方式。但葉面噴施農(nóng)藥易受溫度與光照影響，噴施過程中藥劑漂移不僅造成農(nóng)藥的浪費和環(huán)境的潛在污染，危害非靶標(biāo)生物，還會增加操作者暴露風(fēng)險［1］。灌根施藥是一種應(yīng)用較廣的隱蔽施藥法，該方法將殺蟲劑、殺菌劑施于土壤中，使作物通過“生物抽提”方式將有效成分運輸?shù)街参锏厣喜糠?，從而達(dá)到防治病蟲害的目的［2］，這種施藥方式具有針對性，可以有效保護(hù)天敵，減少環(huán)境污染［3］。He等［1］采用灌根方式，比較了溫室和田間樂果在棉花中的分布及對二斑葉螨（Tetranychus urticae）的防治效果。宗建平等［2］采用噴霧和灌根兩種施藥方法，測定了吡蟲啉在番茄植株中的分布動向及其對煙粉虱（Bemisia tabaci）的防效效果。李強等［4］比較了噴霧、灌根和埋藥3種施藥方式下溴氰蟲酰胺對黃胸薊馬（Thrips hawaiiensis）的防治效果。此外，Dong等［5］研究了灌根施藥方式下，噻蟲啉在溫室盆栽番茄中的殘留消解及其對煙粉虱的防治效果。在施用農(nóng)藥防治病害時，其殘留對環(huán)境和非靶標(biāo)生物會產(chǎn)生一定影響，研究藥劑殘留和消解動態(tài)對于評價作物食用安全性具有十分重要的意義。目前關(guān)于噴霧施藥方式下農(nóng)藥殘留和消解的研究很多［6-9］，但關(guān)于灌根施藥方式下作物食用安全性及農(nóng)藥消解動態(tài)和最終殘留的報道仍較少。因此，本研究選擇2種常用殺菌劑咯菌腈、精甲霜靈和1種殺蟲劑溴氰蟲酰胺為供試藥劑，采用灌根施藥方式處理溫室大棚盆栽辣椒，結(jié)合QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）建立3種藥劑在辣椒和土壤中殘留的分析方法，研究3種藥劑的消解動態(tài)及最終殘留水平，以期為系統(tǒng)評價藥劑的安全性提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ACQUITY UPLC Xevo TQ高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司；B-400勻漿機，瑞士Buchi公司；ME204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；Vortex-Genie2漩渦混合器，北京開源國創(chuàng)科技有限公司；3-30K臺式冷凍離心機，德國Sigma離心機股份有限公司。

咯菌腈標(biāo)準(zhǔn)品（fludioxonil，99.0%）、精甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品（metalaxy-M，99.5%）、溴氰蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（cyantraniliprole，99.2%）購于北京百靈威科技有限公司；精甲·咯菌腈（總有效成分含量62.5 g/L，咯菌腈含量25 g/L，精甲霜靈含量37.5 g/L），10%溴氰蟲酰胺可分散油懸浮劑（美國杜邦公司）；乙腈、甲酸、甲醇為色譜純；無水硫酸鎂、氯化鈉等均為分析純。

1.2 殘留消解試驗設(shè)計

試驗設(shè)計參照NY/T 788－2004《農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》進(jìn)行，于2017年在北京順義植保站基地溫室內(nèi)進(jìn)行最終殘留試驗及消解動態(tài)試驗。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)30盆盆栽辣椒，同時設(shè)置空白對照。

消解動態(tài)試驗：按推薦劑量咯菌腈和精甲霜靈均為0.04 g/L（a.i.）、溴氰蟲酰胺0.13 g/L（a.i）于辣椒半成熟期時灌根施藥1次，每盆施藥50 mL。分別于施藥后0（2 h）、1、3、5、7、11、14、21 d隨機采集辣椒樣品，勻漿后按四分法留樣200 g，同時采集土壤樣品2 kg，去除雜物后四分法留樣200 g。

最終殘留試驗：按推薦劑量和1.5倍推薦劑量分別于辣椒半成熟期時灌根施藥1次，每盆施藥50 mL，分別于施藥后5、7、14 d隨機采集辣椒樣品，勻漿后按四分法留樣200 g，同時采集土壤樣品2 kg，去除雜物后四分法留樣200 g。所有樣品用塑料袋封裝，貯存于-20℃冰箱內(nèi)待測。

1.3 分析方法

1.3.1 提取 分別稱取5.0 g充分勻漿的辣椒樣品和土壤樣品（過孔徑0.60 mm篩）于50 mL圓底旋蓋離心管中，加10 mL乙腈，振蕩30 min，加入2.0 g無水硫酸鎂和0.5 g氯化鈉，渦旋振蕩提取1 min，置于臺式離心機中離心5 min（4℃，5 000 r/min），待進(jìn)一步凈化。

1.3.2 凈化 辣椒樣品：取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至2 mL QuEChERS凈化管（50 mg PSA和150 mg無水硫酸鎂）中，渦旋振蕩1 min，4℃、10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機濾膜，待UPLCMS/MS分析。

土壤樣品：取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至裝有2 mL QuEChERS凈化管（50 mg PSA、50 mg C18填料和150 mg無水硫酸鎂）中，渦旋振蕩1 min，4℃、10 000 r/min離心5 min，過0.22 μm有機濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件 色譜條件：ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速為0.3 mL/min；運行時間5.0 min；柱溫30 ℃。進(jìn)樣體積5 μL。流動相梯度洗脫程序：0～3.5 min，流動相A由70%線性變化至20%；3.5～4.0 min，流動相A由20%線性變化至0；4.0～5.0 min，流動相A由0線性變化至70%。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓3.5 kV；離子源溫度150℃，去溶劑溫度450℃；去溶劑氣和錐孔氣均為高純液氮，去溶劑氣流速800 L/h，錐孔氣流速40 L/h；碰撞氣為高純氬氣；檢測方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）?？┚?、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺的離子采集參數(shù)見表1，在此條件下3種物質(zhì)的MRM色譜圖見圖1。

表1 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺的質(zhì)譜采集參數(shù)

圖1 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺的MRM色譜圖

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制：分別準(zhǔn)確稱取0.001 g咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用乙腈溶液配制10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱內(nèi)保存。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋配制200、100、50、10、5、0.5 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱保存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取一定量的辣椒和土壤空白基質(zhì)樣品，按1.3.1方法進(jìn)行前處理，分別獲得辣椒基質(zhì)和土壤基質(zhì)空白提取液，使用該提取液分別將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液進(jìn)行逐級稀釋配制 200、100、50、10、5、0.5 μg/L基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱保存。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指除被測物外，樣本中雜質(zhì)對被測物定性、定量結(jié)果的影響［10］，計算公式［11］為：

1.3.6 添加回收試驗 分別對空白辣椒樣品和空白土壤樣品設(shè)定3個添加水平，添加濃度為0.01、0.05、0.1 mg/kg，每個水平重復(fù)5次。按1.3.1和1.3.2方法進(jìn)行提取、凈化，按1.3.3條件進(jìn)行測定，計算日內(nèi)和日間平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和Origin軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍及基質(zhì)效應(yīng)

本研究同時繪制了純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線和3辣椒及土壤基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。ME值大于115%則有增強效應(yīng)，小于85%則具有抑制效應(yīng)。由表2可知，辣椒和土壤基質(zhì)對咯菌腈有增強效應(yīng)，分別為135%和128%；對精甲霜靈和溴氰蟲酰胺則具有明顯的抑制效應(yīng)。因此，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

以峰面積（y）對農(nóng)藥質(zhì)量濃度（x）作線性回歸，咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在0.5～200 μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（決定系數(shù)R2＞0.9962），線性方程見表2。

表2 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺的線性方程及基質(zhì)效應(yīng)

2.2 準(zhǔn)確度、精密度及定量限

咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒和土壤中的日內(nèi)和日間平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）測定結(jié)果見表3。表3顯示在0.01、0.05、0.1 mg/kg 3個添加水平下，3種農(nóng)藥在所有樣品中的平均添加回收率分別為93.4%～111.6%、86.9%～108.8%和82.0%～106.4%；日內(nèi)（n=5）和日間（n=15）的RSD值范圍分別為1.3%～8.2%和2.6%～6.8%，結(jié)果均符合農(nóng)藥殘留檢測的要求。通過添加實驗確定，咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒和土壤中殘留分析方法的定量限（LOQ）為0.0005 mg/kg。

2.3 3種農(nóng)藥在辣椒和土壤中的殘留消解動態(tài)

咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺3種農(nóng)藥在辣椒和土壤中的殘留消解方程及半衰期見表4，消解動態(tài)曲線見圖1和圖2。結(jié)果表明，精甲霜靈和溴氰蟲酰胺藥后1～5 d，在辣椒中的殘留量逐漸增加，藥后5 d殘留量達(dá)到最大值，分別為0.06 mg/kg和0.05 mg/kg，隨后殘留量隨時間延長呈降低趨勢。這是由于采用灌根施藥方式，施藥后藥液隨植株汁液傳導(dǎo)至葉片及果實需要一定的時間，植株中的殘留量會呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢［2，4］?？┚嬖诶苯分械臍埩袅侩S時間延長而逐漸降低，但其在所有辣椒樣品中的殘留量均極低，最大殘留量僅為0.007 mg/kg，分析原因可能是由于咯菌腈是一種非內(nèi)吸性新型吡咯類廣譜殺菌劑。分別以3種農(nóng)藥在辣椒中的最高殘留量為原始沉積量對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒中的消解方程，分別為Ct= 0.0074e-0.129t（R2= 0.952）、Ct= 0.0658e-0.08t（R2= 0.897） 和Ct= 0.058e-0.05t（R2= 0.951），均符合一級動力學(xué)方程，降解半衰期分別為5.4、8.7、13.9 d，屬于易降解農(nóng)藥（t1/2＜30 d）。由表4和圖2可知，3種農(nóng)藥在土壤中的殘留量均隨施藥后取樣時間的延長而逐漸降低，半衰期分別為10.2、5.0、6.5 d。

表3 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒和土壤中的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖1 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒中的消解動態(tài)曲線

圖2 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺的在土壤中的消解動態(tài)曲線

表4 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒和土壤中的消解動態(tài)方程

本研究中，3種農(nóng)藥在辣椒果實中的半衰期與已報道的在葡萄、黃瓜、番茄等其他作物噴霧處理方式下得到的半衰期存在一定的差異（表5）。分析原因除了與農(nóng)作物、試驗地氣候和土壤等因素有關(guān)外，與施藥方式也有很大關(guān)系。噴霧處理方式下，風(fēng)吹、雨淋、光照等外部氣候條件對藥劑的影響較為明顯，而種子處理及灌根施藥方式處理下，施用農(nóng)藥在作物植株內(nèi)的消解動態(tài)主要與藥劑在植株內(nèi)的傳導(dǎo)效率、植株的生長代謝以及土壤中微生物豐富度等因素有關(guān)［12-14］。例如，宗建平等［2］比較了噴霧法和灌根法吡蟲啉葉部內(nèi)吸作用，發(fā)現(xiàn)噴霧后藥液只存在于植物葉片表面而未滲進(jìn)葉片表皮以內(nèi)，而根部施藥后藥液隨植株汁液傳導(dǎo)至葉片及果實。李強等［4］分析了灌根施藥后溴氰蟲酰胺在香蕉植株中的傳導(dǎo)效率，發(fā)現(xiàn)施藥后1 d溴氰蟲酰胺在香蕉果實和花瓣中的濃度達(dá)到最高，而本研究所得灌根施藥后5 d溴氰蟲酰胺在辣椒中的殘留量達(dá)到最大，表明溴氰蟲酰胺在不同植株內(nèi)傳導(dǎo)速率有所差異。

表5 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在不同作物中的半衰期

2.4 種農(nóng)藥在辣椒和土壤中的最終殘留量

精甲·咯菌腈（62.5 g/L）懸浮種衣劑和10%溴氰蟲酰胺可分散油懸浮劑按推薦劑量和1.5倍推薦劑量分別于辣椒半成熟期時灌根施藥1次，最終殘留結(jié)果表明，藥后14 d，高劑量處理下3種農(nóng)藥在辣椒中的殘留量均明顯上升，約為低劑量處理的2.8～4.6倍（表6）。但高、低兩種劑量處理下，3種農(nóng)藥在辣椒中的最大殘留量均較低、小于0.1 mg/kg。由于盆栽蔬菜的施藥是特殊場景，目前我國尚未對相關(guān)農(nóng)藥在盆栽蔬菜上的合理使用制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。參照CAC規(guī)定咯菌腈在甜椒中MRL值（0.5 mg/kg）以及我國規(guī)定精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在露天栽種辣椒中MRL值（分別為0.5 mg/kg和1 mg/kg，GB 2763－2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》），施藥后1～14 d各處理的殘留量均符合該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。值得注意的是，在試驗采摘期（1～14 d）內(nèi)，高劑量處理溴氰蟲酰胺在辣椒中的殘留量呈上升趨勢，從食品安全的角度考慮仍有一定風(fēng)險，因此建議采用推薦劑量對盆栽辣椒進(jìn)行灌根施藥。

一般認(rèn)為，農(nóng)藥在土壤中的殘留和降解除了與農(nóng)藥本身的理化性質(zhì)有關(guān)外，還主要與土壤中有機質(zhì)含量、pH、濕度、溫度和植物根系分泌物等多種因素有關(guān)。有研究表明，溫室大棚中土壤濕度以及溫度接近于微生物生長的最適溫度，能夠促進(jìn)農(nóng)藥的快速降解［14］。由表6可知，高、低兩種劑量處理下，隨著采樣間隔時間的延長，3種農(nóng)藥在土壤中的最終殘留量呈下降趨勢。藥后14 d，3種農(nóng)藥在土壤中的殘留量分別為2.50 mg/kg和0.49 mg/kg、0.62 mg/kg和0.49 mg/kg、7.49 mg/kg和2.33 mg/kg。從本試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著施藥劑量的增加，3種農(nóng)藥在土壤中的殘留累積量均明顯增加，當(dāng)施藥劑量增加為1.5倍時，3種農(nóng)藥在土壤中溴氰蟲酰胺的最高累積量分別增加5.1、6.6、3.2倍。

表6 咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在辣椒和土壤中的最終殘留量

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定辣椒和土壤中咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺殘留量的QuEChERS-UPLC-MS/MS分析方法，研究了3種農(nóng)藥在辣椒和土壤中的消解動態(tài)及最終殘留量，結(jié)果表明該方法簡單快捷，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度較高，實用性強；按推薦使用劑量灌根施藥1次，3種農(nóng)藥在辣椒和土壤中的消解動態(tài)方程均符合一級動力學(xué)方程，其在辣椒中的降解半衰期分別為5.4、8.7、13.9 d，土壤中的半衰期分別為10.2、5.0、6.5 d；按推薦劑量和1.5倍推薦劑量灌根施藥后1～14 d內(nèi)，3種農(nóng)藥在辣椒中的最大殘留量均低于規(guī)定的MRL值，但農(nóng)藥殘留量與施藥劑量呈正相關(guān)，高劑量處理下辣椒和土壤中的農(nóng)藥殘留累積量均明顯增加。

本研究初步評估了灌根施藥方式下咯菌腈、精甲霜靈和溴氰蟲酰胺在盆栽辣椒中的殘留動態(tài)及其施用安全性，結(jié)果可為了解灌根施藥方式下3種農(nóng)藥的持效期及其在盆栽辣椒上合理使用相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)，但關(guān)于相同條件下不同施藥方式、環(huán)境因素差異等對結(jié)果的影響還有待進(jìn)一步研究。