調節(jié)性T細胞參與ANCA相關血管炎的發(fā)病機制

劉春麗 商 瑋 蔡 輝

(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，南京210002)

抗中性粒細胞胞漿抗體相關血管炎(Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated vascul-itides，AAV)主要是以中小血管系統(tǒng)性炎癥為主要特征的疾病。根據(jù)臨床和組織病理學特征主要分為以下三類:①肉芽腫性多血管炎(Granulomatosis with polyangiitis，GPA)，②顯微鏡下多血管炎，③嗜酸性粒細胞肉芽腫性多血管炎[1]。免疫調節(jié)細胞的功能缺陷，抑制自身免疫反應的失敗，打破自身耐受是AAV發(fā)病的主要原因[2]。調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是維持外周免疫耐受必需的重要細胞，是阻止自身免疫的關鍵T細胞亞群，參與AAV的免疫調節(jié)功能已經(jīng)得到逐步證實[3]，本文就AAV發(fā)病中T細胞可能的參與機制進行綜述。

1 AAV中T細胞的持續(xù)活化

盡管在AAV的效應階段抗中性粒細胞胞漿抗體(Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody，ANCA)發(fā)揮中心性作用，然而并不能排除T細胞的致病作用。疾病早期反復暴露于同一種抗原以及Tregs的功能障礙，均能導致AAV中T細胞的持續(xù)激活。在AAV受損的器官中均可檢測到活化的T細胞，持續(xù)活化的T細胞數(shù)量與疾病的嚴重程度呈正相關[4]。

在GPA中，CD4+T輔助(T helper，Th)細胞的免疫病理學作用取決于疾病是局限性還是系統(tǒng)性。早期針對GPA患者的研究主要集中在Th1和Th2細胞之間的平衡關系?；顒悠诘腉PA患者CD4+T細胞主要表達Th1細胞相關標志物，進一步發(fā)現(xiàn)局部病變的患者外周循環(huán)和鼻肉芽腫組織中Th1相關標志物占主導地位，而系統(tǒng)性病變患者中Th2相關標志物則更為突出。最近證實在GPA患者中抗原特異性Th17細胞擴增，與疾病活動性和是否維持藥物治療無關[5]?；顒有訥PA患者中血清白介素-17(Interleukin-17，IL-17)水平升高，當進入緩解期時仍然維持在較高水平。利用蛋白酶3(Proteinase 3，PR3)體外刺激GPA患者的外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)能夠導致IL-17和Th17細胞的轉錄因子RORγt表達增加，表明Th17細胞很可能參與AAV的免疫發(fā)病[6]。

2 AAV中啟動和維持T細胞活化的機制

AAV中T細胞活化的啟動和維持機制尚不清楚，有研究表明Tregs免疫抑制功能失常，免疫調節(jié)的打亂可能是維持AAV中T細胞持續(xù)活化的重要因素。

2.1 Tregs分子表型 40多年前首次發(fā)現(xiàn)T細胞具有免疫抑制能力，直到1995年才發(fā)現(xiàn)一類表達IL-2受體α鏈(CD25)的CD4+Th細胞亞群是阻止自身免疫反應的關鍵。敲除野生型小鼠的CD4+CD25+T細胞并將剩下的T細胞轉染同源無胸腺小鼠體內能夠誘導發(fā)生自身免疫和多器官損傷，當將CD4+CD25+T細胞回輸后能夠阻止自身免疫的發(fā)生[7]。隨后在人體內也發(fā)現(xiàn)相似的CD4+抑制性T細胞或Tregs。共同培養(yǎng)CD4+CD25hiT細胞和CD4+CD25-反應性T細胞，發(fā)現(xiàn)CD4+CD25hiT細胞能夠直接抑制CD4+CD25-反應性T細胞的增生和細胞因子形成。這些結果均表明Tregs表型CD4+CD25+的存在[8]。隨后發(fā)現(xiàn)在Tregs表達的關鍵標記物轉錄因子FoxP3能將其與其他CD4+T細胞區(qū)分開來。首先在scurfy小鼠品系中檢測到FoxP3編碼scurfin蛋白，F(xiàn)oxP3基因的X連鎖隱性突變導致16～25 d齡的半合子雄性小鼠死亡，淋巴細胞顯示過度增殖，多個器官中CD4+T細胞浸潤并產生大量細胞因子[9]。X連鎖綜合征(即IPEX)患者也存在FoxP3的突變，主要以免疫調節(jié)失衡、內分泌失調和腸道疾病為主要特征。此外一些研究顯示scurfy小鼠和IPEX患者不存在CD4+CD25+Tregs。利用逆轉錄病毒將FoxP3轉染至幼稚CD25-CD4+T細胞中能夠誘導T細胞的產生，其在表型上和功能上類似于Tregs。以上結果表明FoxP3對于Treg的成熟和功能的發(fā)揮是必需的。根據(jù)幼稚和記憶CD4+Th細胞中FoxP3的表達水平不同，人外周血FoxP3+CD4+T細胞分為CD45RA+FoxP3lo靜息Tregs(CD45RA+FoxP3loresting Tregs，rTregs)，CD45RA-FoxP3hi活化Tregs(CD45RA-FoxP3hiactivated Tregs，aTregs)和分泌IFNγ-和IL-2的CD45RA-FoxP3loCD25+Tregs三種類型。前兩者(即rTregs和aTregs)在體外就能夠發(fā)揮有效的抑制功能，而CD45RA-FoxP3loCD25+Tregs卻不能。這表明僅憑FoxP3不能定義真正的抑制性Tregs。已有研究發(fā)現(xiàn)人Tregs存在幾種不同的FoxP3亞型。第一種亞型是全長型FoxP3(Full-length FoxP3，F(xiàn)oxP3fl)，第二種亞型缺少外顯子2型(Lacking exon 2，F(xiàn)oxP3Δ2)。不同的FoxP3亞型影響Tregs功能和分類。FoxP3fl與RORγt(Th17細胞的轉錄因子)相互作用并抑制Th17細胞基因的表達，而FoxP3Δ2型卻不能。Tregs和Th17細胞的發(fā)育相互影響[10]。在體外中性條件下，β型轉化生長因子(Transforming growth factor β，TGFβ)將平衡傾向功能性FoxP3+Tregs方向發(fā)展，而在炎性細胞因子IL-1β、IL-2、IL-15等存在下，功能性Tregs向產生IL-17的非功能性Tregs轉化。因此，F(xiàn)oxP3結合CD25、CD45RA的表達對定義真正抑制性Tregs至關重要。

2.2 Tregs和作用機制 Tregs調節(jié)免疫的確切機制尚不清楚，可能通過分泌抗炎細胞因子、細胞溶解、代謝紊亂和調節(jié)樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)的成熟和功能的發(fā)揮等不同機制作用的。Tregs能夠產生大量細胞炎性因子如IL-10、IL-35和轉化生長因子(Transforming growth factor β，TGF-β)抑制免疫細胞活化；Tregs釋放酶(顆粒酶A或B)通過促進細胞溶解是誘導效應細胞凋亡的另一種機制；代謝紊亂，如當IL-2缺乏時誘導效應細胞死亡，Tregs還能夠通過縫隙連接將可溶性介質環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)轉移到靶細胞效應T細胞和DC中來抑制效應細胞功能發(fā)揮。在靶細胞中，cAMP誘導抑制細胞增殖和IL-2產生的誘導型cAMP早期阻遏物(Inducible cAMP early repressor，ICER)形成。最后，Tregs通過抑制性表面分子淋巴細胞活化基因(Lymphocyte activation gene，LAG)3和毒性T淋巴細胞相關抗原(Cytotoxic T lymphocyte-associated Ag，CTLA)-4調節(jié)DC成熟。當DC感知到這些分子的存在時，開始產生吲哚胺2，3-雙加氧酶反過來抑制其他免疫細胞[11]。Tregs引發(fā)抑制的機制取決于抗原的劑量。高劑量抗原通過誘導Fas介導的細胞凋亡或T細胞受體(T cell receptor，TCR)連接引發(fā)有效抑制效應，這兩者都導致T細胞無反應性，而低劑量抗原僅誘導IL-10或TGF-β的分泌[12]。Tregs可以通過抑制協(xié)同刺激因子作用和分泌抗炎細胞因子來抑制效應T細胞的活化以預防自身免疫[13]。在移植物抗宿主病中的研究發(fā)現(xiàn)，擴增的Treg對單核細胞的作用導致促炎細胞因子IL-6、TNF-α的產生和NF-κB活化的減少。此外，單核細胞與擴增的Tregs共同培養(yǎng)后共刺激因子和MHCⅡ類分子的表達下調，M2巨噬細胞特異性標志物、CD206、血紅素加氧酶-1、IL-10的產生增加。與擴增的Treg共培養(yǎng)的單核細胞能夠使產生IL-17的T細胞能力降低，這種促炎性Th17擴增能力的減少是共刺激分子CD86低表達所導致的。因此，擴增的Treg具有誘導單核細胞表型和功能變化的能力，這可能對移植中的耐受誘導、移植物抗宿主病和自身免疫疾病的預防和治療至關重要[14]?？傊?，Tregs采用多種機制發(fā)揮其免疫抑制作用，并在抑制自身免疫反應中發(fā)揮關鍵作用。

2.3 AAV中的Tregs 在AAV中，Tregs免疫抑制功能的缺陷導致免疫細胞持續(xù)活化和慢性自身免疫炎癥的發(fā)展。關于AAV免疫調節(jié)的研究多集中在Tregs的異常功能和/或比例改變上。盡管大多數(shù)研究都認為在AAV中Tregs的免疫抑制作用受損，主要是由數(shù)值或功能變化引起還是兩者共同作用尚存在爭議。

2.3.1 AAV中Tregs的比率和功能改變 關于AAV中Tregs的比率存在一些爭議，通過比較緩解期GPA患者與健康人群或其他患者，GPA患者外周血中CD25hiFoxP3+Tregs的比例水平明顯增加，但也有報道指出比率下降。CD4+CD25hiTreg的降低與患者接受的常規(guī)免疫抑制治療相關，B細胞清除治療患者的外周循環(huán)中Tregs數(shù)目與健康者相似，而與常規(guī)治療的患者相比顯著增加，而CD4+CD25hiT細胞區(qū)域的FoxP3表達未進行評估，盡管通過它能識別出活化的Tregs。另一項研究發(fā)現(xiàn)在疾病緩解期(≥1年)Tregs的比率顯著增加，與免疫抑制治療無關。Tregs的比率伴隨著Th2比率的增加而增加，活動性AAV中Tregs數(shù)量的減少使得Th17細胞在緩解期擴增，而免疫抑制藥物抑制Th17細胞并允許Tregs擴增導致Th細胞失衡[15]。綜合上述實驗結果表明免疫抑制藥物可恢復緩解期AAV患者的Tregs比例。雖然目前對AAV的Treg比率沒有達成共識，但大部分研究都報道了大多數(shù)AAV患者中Tregs的抑制功能出現(xiàn)降低。GPA患者中FoxP3+Tregs的比重增加了，通過其與AAV患者Tregs共培養(yǎng)后反應性T細胞增殖能力增加進而證明其抑制功能減弱?？傊@些結果表明盡管對AAV患者Tregs比重存在爭議，但大多數(shù)研究都承認Treg功能減弱的事實。

2.3.2 AAV中Tregs功能障礙的潛在原因 盡管大多數(shù)研究顯示AAV患者中Tregs的抑制功能減弱，可能的相關機制包括IL-6介導Tregs與Th17的轉換、降低IL-2的反應性和增加FoxP3剪切變體的表達以及FoxP3啟動子甲基化。炎癥微環(huán)境可能誘導Tregs免疫抑制活動降低，如在糖尿病患者中Tregs能轉變?yōu)門h1細胞。Th1樣Tregs除FoxP3外還表達Tbet和CXCR3，并分泌IFNγ，表明這些Tregs已失去其免疫抑制功能[16]。當用同種異體抗原呈遞細胞，尤其是單核細胞刺激時，CD25hiFoxP3+T細胞可以轉化為產生IL-17的T細胞，外源性IL-1β、IL-23和IL-21能夠增強這種轉化，而IL-6或TGF-β卻不能[17]。類風濕關節(jié)炎(RA)和癌癥患者炎癥部位FoxP3的Th17樣Tregs表達更豐富。而在AAV中，炎癥部位Tregs也似乎更傾向于產生IL-17，這些可能是由于炎癥微環(huán)境中IL-6和TGF-β的產生增加造成的。炎癥部位Tregs免疫抑制能力的下降可能與暴露于IL-6和TGF-β有關。AAV患者Th17水平升高和Treg功能減弱，表明這種機制可能也參與AAV的發(fā)病。IL-6似乎發(fā)揮更重要的作用，當暴露于IL-6時，Tregs失去其抑制功能，同時支持Tregs的抑制功能的轉錄因子Helios表達水平也降低。單克隆抗體Tocilizumab阻斷IL-6受體的RA患者，與未阻斷治療者、健康對照者相比，Helios+FoxP3+CD4+T細胞的比例增加[18]。在AAV中，炎癥局部高水平IL-6促進Tregs向產生IL-17的T細胞轉化，抑制功能喪失，進而導致持續(xù)的效應細胞活化。AAV中Tregs的抑制能力下降可能與IL-2的反應性降低有關。與健康對照者相比，AAV患者中活化的Th細胞和Tregs上IL-2受體(IL-2R，CD122)β鏈表達顯著降低[19]。IL-2是一種細胞因子，Tregs在穩(wěn)態(tài)和炎癥條件下功能的發(fā)揮都需要它。當Tregs對IL-2的反應能力下降時可能不會發(fā)揮其抑制功能[20]。

FoxP3亞型的異常表達可能是AAV中Tregs功能異常的原因。FoxP3fl與RORγt相互作用并抑制Th17細胞基因的表達，而FoxP3Δ2卻不能。因此，F(xiàn)oxP3Δ2可能導致Tregs中RORγt的顯性表達，從而導致IL-17的產生，并將Tregs向致病性Th17細胞轉化。與健康對照者相比，活性和非活性AAV患者中Th細胞中的FoxP3Δ2型均增加，F(xiàn)oxP3fl比例卻降低。AAV患者Tregs抑制能力的下降程度與缺乏外顯子2型Tregs的比例呈正相關[21]。總之，F(xiàn)oxP3的剪接變體的表達可能是抑制功能降低的原因。

Tregs的表觀遺傳學異常也是AAV中Tregs抑制活性下降的原因。FoxP3啟動子中的CpG基序，也稱為Treg特異性去甲基化域(Treg-specific demethylated region，TSDR)，去甲基化后才能導致FoxP3基因轉錄[22]。在靜息態(tài)的常規(guī)T細胞中，該基序僅輕微發(fā)生去甲基化。乙?；M蛋白與Tregs中的FoxP3啟動子較常規(guī)T細胞關聯(lián)性更強，這可能使得FoxP3啟動子更容易接近RNA聚合酶，Tregs中FoxP3特異性轉錄，激活Tregs抑制功能。失活的Tregs不表達FoxP3，抑制活性下降，這些均與去甲基化TSDR相關[23]。AAV中的組蛋白乙?；潭仁欠褫^低，以及是否增加FoxP3啟動子的甲基化并導致更多的無活性Treg產生需要進一步研究。盡管上述這些可能與AAV中Tregs的抑制能力降低有關。然而，其在AAV中受損的確切機制仍有待進一步研究。

總之，AAV免疫調節(jié)細胞亞群的數(shù)值和功能改變，自身反應性T細胞的清除和充分抑制的失敗，導致針對自身蛋白免疫應答的啟動和蔓延，自身反應性效應T細胞的不斷增殖和致病性自身抗體產生。盡管存在研究之間的差異，但在大多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)Tregs的抑制功能減弱。T細胞中效應細胞和調節(jié)細胞之間的失衡是AAV發(fā)病機制的一個重要方面，這表明當構建恢復這種平衡時對AAV患者有顯著的益處。