動物源食品中呋喃西林及其代謝物氨基脲研究進(jìn)展

曹愛玲，余招鋒，陳怡琳，陳佳瑩，沈 立

（1.錢江海關(guān)，浙江杭州 310000；2.紹興海關(guān)，浙江紹興 312000；3.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013）

隨著生活水平的不斷提高和生活習(xí)慣的改變，人們對動物源食品的需求逐漸增長，同時動物源食品中的藥物殘留問題也備受關(guān)注。作為硝基呋喃類藥物之一的呋喃西林，具有廣譜抗菌作用，其代謝物氨基脲（SEM）在動物源食品中與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合形成的穩(wěn)定殘留，具有致癌、致畸性，可通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入會給人體造成嚴(yán)重?fù)p害，故對動物源食品中呋喃西林及其代謝物SEM進(jìn)行研究及檢測具有重要意義。

1 呋喃西林的藥理作用及其應(yīng)用

呋喃西林具有較強的抗菌作用。在進(jìn)入動物體內(nèi)后，能干擾細(xì)菌糖代謝過程，破壞細(xì)菌氧化酶系統(tǒng)，抑制其新陳代謝，導(dǎo)致細(xì)菌因代謝紊亂而死亡。呋喃西林對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有抗菌作用，但對于綠膿桿菌、肺炎雙球菌和假單胞菌屬及變形桿菌屬作用不大。該藥因抗菌譜廣，曾被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，用以抵抗由大腸桿菌和沙門氏菌引起的魚類疥瘡病、赤鰭病、潰瘍病等。

2 呋喃西林及其代謝物SEM的檢測方法

早期國內(nèi)外對呋喃西林及其代謝物SEM的殘留檢測，大多集中在對其原藥的檢測上。Nouws等[1]對硝基呋喃類原藥進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)殘留的呋喃西林在活動物體內(nèi)很不穩(wěn)定，能被迅速分解。但有研究表明，其代謝物SEM可在動物組織中殘留長達(dá)數(shù)周，在蒸煮、烘烤、磨碎和微波加熱過程中也無法被有效降解[2]。雖然呋喃西林原藥不穩(wěn)定，對光敏感，可在動物體內(nèi)被迅速代謝，但其代謝物SEM能與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，極不易被降解[3-6]，故目前歐盟、美國和我國均以SEM作為標(biāo)示殘留物，對呋喃西林進(jìn)行殘留檢測和監(jiān)控。目前應(yīng)用于SEM檢測的方法主要有高效液相色譜（HPLC）及其聯(lián)用技術(shù)和免疫分析法兩種。

2.1 HPLC及其聯(lián)用技術(shù)

HPLC具有有效分離和純化有機化合物的作用，在藥物殘留檢測方面應(yīng)用比較廣泛[7-10]?，F(xiàn)有的HPLC及其聯(lián)用技術(shù)包括，高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[11-15]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）[16]、同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）。

李東利等[17]利用HPLC-MS/MS檢測SEM在蝦體內(nèi)的消除規(guī)律。首先對蝦組織樣品進(jìn)行預(yù)處理，再加入混合內(nèi)標(biāo)工作溶液、鹽酸溶液和2-硝基苯甲醛溶液，將其水解和衍生化，后再加入磷酸氫二鉀溶液、乙酸乙酯溶液和甲醇水溶液，將其提取純化；在柱溫為室溫，進(jìn)樣量為20 μL條件下，利用色譜柱Agilent XDB C18（100 mm×2.1 mm，5 μm），20 d后測得蝦肌肉中SME殘留量最大，為（11.09±0.47）μg/kg，其次是鰓、甲殼、血淋巴和肝胰腺，依次為（1.77±0.53）（1.56±0.66）（0.69±0.13）和（0.55±0.07）μg/kg。付樹林等[18]建立的HPLC可同時檢測呋喃西林代謝物SEM和呋喃唑酮代謝物AOZ（3-氨基-2-惡唑烷基酮）在海參組織中的代謝消除規(guī)律，檢測得到的SEM和AOZ回收率在89.1%～98.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%；在0.05～100 ng/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)衍生后線性良好，相關(guān)系數(shù)＞0.995，最低檢測限為0.5 μg/kg。黃鼎南等[19]采用HPLCMS/MS調(diào)查分析甲殼類水產(chǎn)品中呋喃西林代謝物SEM的來源，其對樣品處理較簡單，經(jīng)磷酸氫二鉀溶液和乙酸乙酯提取，用氮氣在38 ℃水浴條件下吹干，乙腈-0.2%乙酸溶液（15:85，V/V）溶解，正己烷脫脂純化，用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定得到檢出限為0.25 μg/kg（S/N＞3），定量限為0.50 μg/kg（S/N＞10）。黃宣運等[20]利用HPLC-MS/MS分析SEM在中華絨螯蟹體內(nèi)的殘留和消除規(guī)律，檢出限為0.25 μg/kg（S/N≥3），定量限為0.5 μg/kg（S/N≥10）。

Mottier等[21]建立了一種LC-MS/MS與電噴霧電離法相結(jié)合的方法，來檢測4種硝基呋喃類代謝物，其中也包括對呋喃西林代謝物SEM的檢測，其檢測結(jié)果低于歐盟規(guī)定的最低檢測限量（1 μg/kg）。目前HPLC及其聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于制藥業(yè)、藥物分析與研制等領(lǐng)域，在環(huán)境分析中也起著重要作用。現(xiàn)國際上普遍采用該方法來檢測動物源食品中呋喃西林及其代謝物SEM的存在。

2.2 免疫分析法

目前，免疫分析法在食品分析應(yīng)用中越來越廣泛，其包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[22-24]、膠體金免疫分析檢測技術(shù)（GICT）、熒光偏振免疫分析方法（FPIA）。沈玉棟等[25]通過新合成的人工抗原CEPS-EM-BSA免疫新西蘭大白兔，制備出NPSEM多克隆抗體，建立了呋喃西林代謝物SEM的熒光偏振免疫分析方法。該方法的檢出限為 8.3 μg/L，IC50為 47.9 μg/L，線性范圍為15.8～145.7 μg/L，與其他硝基呋喃類藥物的CR均小于0.1%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.3%。黃登宇等[26]建立了測定呋喃西林代謝物SEM的競爭生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法（BA-ELISA）。該方法操作簡便，經(jīng)碳酸鹽緩沖液稀釋包被原CPSEM-OVA，PBST溶液洗板，NPSEM溶液與單克隆抗體反應(yīng)，在37 ℃條件下，用Biontin-IgG溶液和SA-HRP溶液孵育，顯色底物液顯色，硫酸終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光度值為1.020 8，IC50為 0.601 μg/L，線性范圍為 0.074～4.883 μg/L，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～3.6%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～5.1%。該法可用于食品中殘留SEM的快速篩查。

2.3 HPLC與免疫分析法的比較

免疫分析法樣品前處理簡單，操作步驟簡便，耗資低，靈敏度和精密度高，一般適用于篩選檢測和定量分析。高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)的樣品前處理較復(fù)雜，操作步驟相對繁雜，檢測儀器昂貴，耗資高，但因分辨率高，應(yīng)用相當(dāng)廣泛，可進(jìn)行定性、定量分析，其中HPLC-MS法靈敏度較低，難以達(dá)到恒量分析要求。

3 食品中的SEM來源

歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)經(jīng)常發(fā)出來自中國、越南、泰國等國家的動物源性產(chǎn)品中SEM超標(biāo)的警告。追蹤分析發(fā)現(xiàn)，部分涉嫌產(chǎn)品未使用過呋喃西林藥物，因而引發(fā)了國內(nèi)外學(xué)者對食品中SEM來源的研究。現(xiàn)有研究表明，除了動物源食品中使用呋喃西林藥物導(dǎo)致SEM殘留外，食品中的SEM還可來源于食品包裝、面粉改良劑及食品加工程序等[27]。

3.1 偶氮甲酰胺（ADC）

ADC是一種速效面粉增筋劑，具有漂白和氧化雙重作用。它本身與面粉不發(fā)生反應(yīng)，但將其添加在面粉中并加入水?dāng)嚢钑r，能快速釋放出活性氧，將面粉蛋白中氨基酸的硫氫基氧化成二硫鍵，使蛋白質(zhì)鏈相互連接而構(gòu)成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。王遠(yuǎn)成等[28]研究發(fā)現(xiàn)，ADC可用于做小麥粉處理劑和焙烤食品的快速發(fā)酵劑，在面團成型過程中加入，能改善面團的物理操作性質(zhì)和高筋力所需的組織結(jié)構(gòu)。ADC被認(rèn)為是SEM的替代來源。Pereira等[29]將面粉樣品經(jīng)過水解和2-硝基苯甲醛衍生后產(chǎn)生的3-氨基-2-噁唑烷基酮作為內(nèi)標(biāo)，采用HPLC-MS/MS測定面粉（添加ADC）中的SEM含量為2～5 ng/g。Noonan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，添加了ADC的面包在和面、一次醒發(fā)和二次醒發(fā)這3個階段都有少量SEM生成，而經(jīng)過烘烤后則有大量SEM生成（約400 μg/kg）。蔣志紅等[31]研究表明，ADC在一定濕熱條件下能導(dǎo)致面粉及面包蝦產(chǎn)品中形成SEM。黃曉姍等[32]研究發(fā)現(xiàn)，面制品中ADC在熱處理條件下會生成SEM，且生成率隨著溫度升高而增大。

同時，ADC是一種常用的化學(xué)發(fā)泡劑，被廣泛應(yīng)用于各種塑料級橡膠產(chǎn)品生產(chǎn)，如鞋類、皮革、壁紙、包裝材料等。有研究表明，各種灌裝食品，如果醬、蜂蜜、番茄醬，蛋黃醬、調(diào)味品和嬰兒食品中，可檢測到SEM[33]，含量在1～25 μg/kg。造成SEM形成的原因是灌裝食品的金屬蓋密封墊圈含有ADC，在高溫下可受熱分解產(chǎn)生SEM，并進(jìn)入到與其接觸的食品中。目前歐盟已禁止ADC作為發(fā)泡劑使用。

3.2 次氯酸鹽

次氯酸鹽因具有強氧化性和漂白性而被廣泛用于食品加工、水產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)的衛(wèi)生處理和消毒。Hoenicke等[34]通過測定用不同濃度的次氯酸鹽溶液處理卡拉膠、雞肉、蛋白粉、刺槐豆膠、白明膠和淀粉等不同樣品中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)SEM的總量，發(fā)現(xiàn)用含1%活性氯的次氯酸鹽溶液處理的這6種樣品均產(chǎn)生了SEM，其中淀粉中含量約為1 μg/kg，蛋白粉中約為20 μg /kg。鑒于水產(chǎn)品具有豐富的精氨酸、組氨酸、瓜氨酸等含氮物質(zhì)，且這些氨基酸都具有SEM分子結(jié)構(gòu)，因此他們推測這些氨基酸在次氯酸溶液處理下能夠轉(zhuǎn)化成SEM。楊曦等[35]也發(fā)現(xiàn)，在食品加工過程中，次氯酸鈉與食品作用能產(chǎn)生SEM，其含量與次氯酸鈉濃度、作用時間和接觸面積成正比。

3.3 SEM內(nèi)源性

SEM天然存在于一些動物體內(nèi)，不是由呋喃西林污染引起的。例如，周萍等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在未使用任何呋喃西林藥物的情況下，雄蜂蛹在生長后期隨著體內(nèi)甲殼素含量的增加，SEM含量從0.12 μg /kg 增加到 15.6 μg /kg。張睿等[37]通過檢測分析羅氏沼蝦和中華絨鰲蟹等樣品肌肉和甲殼中SEM含量，發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦活體蝦殼、死體蝦殼、水煮熟殼中SEM濃度相當(dāng)，蝦殼中的SEM濃度是蝦肉中的7～12倍，由此得出羅氏沼蝦甲殼中的SEM并非由呋喃西林藥物代謝所致，可能是內(nèi)源性的。Poucke等[38]也在蝦殼中發(fā)現(xiàn)SEM存在。彭婕等[39]以中華絨螯蟹為對象，發(fā)現(xiàn)蟹殼中可檢出SEM（檢出率為100%），肌肉、肝臟、腮、性腺等組織中均無SEM被檢出。此外，該試驗經(jīng)進(jìn)一步驗證，認(rèn)為蟹殼中的SEM來源可能與甲殼中結(jié)合蛋白水解氨基酸的變化有關(guān)。此外，有研究者在中華鱉粉[40]、黃粉蟲[41]中也都檢測到SEM。

4 結(jié)語

硝基呋喃類藥物在動物源食品中的添加利用所帶來的食品安全問題，一直受到國內(nèi)外的關(guān)注。國際上大多數(shù)國家已明令禁止在動物源食品生產(chǎn)過程中使用呋喃西林，而其代謝物SEM則被用來檢測食品中是否使用呋喃西林的標(biāo)志物。目前，國內(nèi)外采用的HPLC及其聯(lián)用技術(shù)和免疫分析法，能夠較為精準(zhǔn)、快速地測出食品中的SEM含量。此外，有大量研究表明，SEM不僅來源于動物源食品前期飼養(yǎng)階段使用的呋喃西林，還與食品生產(chǎn)包裝過程中使用的ADC、在食品消毒與漂白過程中使用的次氯酸鹽以及SEM內(nèi)源性有關(guān)系。因此，需加強監(jiān)管，盡量避免SEM污染給人體健康帶來的危害。