淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒實時熒光RPA快速檢測方法的建立

熊 煒，陳鴻軍，魏曉鋒，王 艷，胡建華，黃忠榮

（1.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.上海實驗動物研究中心，上海 201203）

由淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）引起的淋巴細胞脈絡叢腦膜炎，是一種嚙齒類動物多發(fā)的急性人獸共患病，臨床表現為流行性感冒、腦膜炎、腦炎等癥狀[1-2]。LCMV的主要宿主是家鼠和倉鼠等嚙齒類動物，但犬、貓、猴等動物和人類也可感染[3-5]。1989年美國一家癌癥研究所報道，實驗人員在不知試驗用祼鼠感染LCMV的情況下，使用該裸鼠進行腫瘤移植手術而使人感染LCMV[6]。人感染LCMV的主要途徑是直接接觸帶毒動物的排泄物或分泌物。成年人感染LCMV 8 ～13 d后出現臨床癥狀，典型表現為發(fā)熱、頭痛、肌肉痛、嘔吐等類似流感樣癥狀，偶有單側睪丸痛、“妄言”等癥狀，嚴重者表現為腦膜炎、聽力下降，還有約三分之一的患者沒有臨床癥狀[7-8]。目前檢測LCMV的方法主要有血清中和、免疫熒光、免疫組化、ELISA、RT-PCR和熒光RT-PCR等[9-11]。鑒于LCMV隱性感染的特征及人獸共患的危害性，為加強入境野生和實驗用嚙齒類動物的LCMV篩查和流行病學調查，本研究建立了LCMV實時熒光RPA快速檢測方法，并通過與RT-PCR方法對比，評估了其特異性、敏感性和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TRIzol：購自Invitrogen公司；Taq酶、AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、隨機引物、DNA Marker（DL 2 000 bp）：購自Takara公司；RPA檢測試劑：購自英國TwistDx Inc公司；DNA抽提試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kits）：購自QIAGEN公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）：購自Gibico公司；其他試劑：購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

1.2 病毒樣品來源及處理 LCMV陽性組織樣品、血清和細胞培養(yǎng)物為本室保存。陽性組織樣品加等體積生理鹽水研磨勻漿，3 000g離心15 min，收集上清液待檢。本研究使用的其他病毒，如小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）、小鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，MPV）、仙臺病毒（Sendai virus，SV）、呼腸孤病毒3型（reovirus type 3，Reo-3）、小鼠細小病毒（parvovirus minute virus of mice，MVM）、鼠痘病毒（ectromelia virus，EV）均來自上海實驗動物研究中心。上述病毒樣品經核酸分離提取制備成DNA或cDNA備用。

1.3 核酸抽提及cDNA模板制備

取100 μL待檢上清液或血清，加1 mL TRIzol試劑進行RNA提取；加30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取11 μL RNA溶液，加5倍逆轉錄酶濃縮緩沖液 4 μL、dNTP 1 μL、隨機引物 1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、AMV逆轉錄酶2 μL，置PCR儀上42 ℃反應1 h，即得cDNA模板。對照DNA病毒樣本采用DNA抽提試劑盒進行，最后將提取的DNA用50 μL水溶解。

1.4 PCR檢測

針對LCMV基因保守區(qū)域設計引物，擴增基因片段大小為554 bp，其上游引物為：5'-AGT GAT GAG TCC TTC ACA TCC CA-3'；下游引物為：5'-GGA TCC TAG GCA TTT GAT TGC GC-3'。在PCR薄壁管中，加cDNA或DNA模板1 μL，10倍 Taq 酶濃縮緩沖液 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，上下游引物各0.25 μL，Taq酶0.25 μL，加水補足總體積至25 μL。將PCR管置于PCR儀上，按如下程序擴增：首先94 ℃ 3 min；然后94 ℃ 15 s，56 ℃15 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最后 72 ℃ 3 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統拍攝。

1.5 實時熒光RPA引物和探針設計

使用Vector NTI Suite軟件，分析不同國家和地區(qū)分離的LCMV基因保守序列，用Primer Express軟件設計實時熒光RPA引物和探針。實時熒光RPA檢測的上游引物（RPA-LCMVF）序列為：5'-ATG ATG CAG TCC ATG AGA GCA CAG TGT GGG GTG-3'；下游引物（RPA-LCMVR）序列為：5'-GCA CAA CCG GGA TTA ACT TCC TCA GTA ATT GGC-3'。RPA探針（RPA-LCMVP）序列為：CCC TTC TAT TCT GTG AGT CTA AGA GTT TCC TGA（FAM-dt）（THF）（BHQ1-dt）ATC AGA CCC TTG-C3Spacer。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.6 實時熒光RPA檢測

采用GENIE Ⅱ恒溫擴增PCR儀。反應體系為：25 μL 2 倍反應緩沖液、7.2 μL dNTP、5 μL 10 倍探針酶混合物，上下游引物（RPA-LCMVF、RPALCMVR）各 2.1 μL、10 μmol/L 熒光探針 0.6 μL?；靹蚝?，再加入2.5 μL 20倍核心反應液、1 μL 50倍RT反應液、1 μL 50倍Exo反應液；混勻后，最后加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸鎂、1 μL待檢核酸溶液。反應條件為：39 ℃孵育25 min。反應結束后，查看熒光擴增曲線進行結果判定。

2 結果

2.1 特異性試驗

分析LCMV基因序列，設計引物和熒光探針，建立了LCMV熒光RPA方法。使用該方法分別檢測鼠LCMV、MHV、MPV、SV、Reo-3、MVM和EV等病毒核酸，同時使用PCR方法進行對比檢測。結果顯示：經實時熒光RPA檢測，LCMV核酸樣品在反應5～10 min后熒光信號出現顯著增強，而其他鼠病毒核酸樣品均未檢測到熒光信號的變化（圖1）；PCR檢測得到了相同結果，僅LCMV核酸樣品擴增出了554 bp的單一基因片段，其他鼠病毒未出現基因擴增（圖2）。

圖1 實時熒光RPA檢測LCMV的特異性試驗結果

2.2 敏感性試驗

為測試建立的實時熒光RPA檢測方法的敏感性，將LCMV的cDNA進行定量并梯度稀釋，制備濃度分別為 1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、0.1 fg/μL的模板，再用建立的實時熒光RPA方法和RT-PCR方法進行對比檢測。結果顯示，實時熒光RPA和RT-PCR方法的檢測下限均為1 pg/μL（圖3、圖4）。

圖2 RT-PCR檢測LCMV的特異性試驗

圖3 實時熒光RPA檢測LCMV的敏感性試驗

圖4 RT-PCR檢測LCMV的敏感性試驗

2.3 感染鼠的組織樣本檢測

為驗證建立的RPA檢測方法的可靠性，將實時熒光RPA方法應用于LCMV感染鼠的組織樣本和30份LCMV陰性血液樣本檢測，并使用RT-PCR方法進行驗證。結果顯示：使用實時熒光RPA方法能在LCMV感染鼠的腦、肝、脾、肺、腎、血液等組織樣本檢測到顯著增強的熒光信號，而LCMV陰性樣本均未出現熒光曲線擴增；RT-PCR在這些LCMV陽性組織樣本中擴增出了條帶單一的554 bp的基因片段，而陰性樣本均未出現擴增（圖5、圖6）。

圖5 實時熒光RPA檢測LCMV感染鼠的組織樣本

圖6 RT-PCR檢測LCMV感染鼠的組織樣本

3 討論

近年來實驗動物的LCMV感染率一直保持較低水平，這與實驗動物硬件設施和管理水平的提高密不可分。由于LCMV隱性感染率較高，大多不出現明顯的臨床癥狀，因此依賴傳統的血清學檢測方法可能存在較高的漏檢率。同時，由于LCMV的宿主范圍較廣，并可在環(huán)境中長期存活，所以做好防范工作，提高檢測和監(jiān)測效率，是降低實驗動物LCMV感染的重要保障。為此，本研究建立了LCMV實時熒光RPA快速檢測方法。該實時熒光RPA檢測方法具有良好的特異性，與LCMV同步檢測的MHV、MPV、SV、Reo-3、MVM和EV等病毒均未出現RPA熒光信號的擴增。通過與傳統RT-PCR檢測方法比對，證實該實時熒光RPA檢測LCMV的方法具有與RT-PCR一致的特異性和敏感性。將建立的實時熒光RPA方法應用于LCMV感染鼠的腦、肝、脾、肺、腎、血液等組織樣本和30份LCMV陰性血清樣本檢測，證實建立的實時熒光RPA方法具有與RT-PCR一致的穩(wěn)定性和可靠性，實時熒光RPA檢測中未出現陽性樣品的漏檢以及陰性樣品的誤檢出。而與傳統RT-PCR方法相比，實時熒光RPA檢測方法的優(yōu)勢在于檢測周期極短，包括結果判讀在內，僅需10～20 min；操作簡單，只需將核酸與檢測體系混合放于恒溫設備中即可，RNA檢測不需逆轉錄過程；檢測設備便攜，筆記本大小，一次充電可運行12 h；結果判定簡便直觀，特別適合于現場及野外使用。

本研究建立的實時熒光RPA快速檢測方法豐富了現有的LCMV檢測體系，特別適合于野外監(jiān)測點、嚙齒類實驗動物繁育場和一線獸醫(yī)檢測實驗室使用，對控制LCMV傳播，保護養(yǎng)殖人員和實驗操作人員的健康，減少養(yǎng)殖場的經濟損失具有重要意義。