重組梅毒螺旋體診斷抗原的研究進(jìn)展

王斯倩,符 波,趙宇龍,廖夢(mèng)佳,李長(zhǎng)清,曹龍古,曾鐵兵

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一種慢性多階段發(fā)展的性傳播疾病,嚴(yán)重危害成人與新生兒身心健康。目前尚無(wú)疫苗進(jìn)行特異性預(yù)防,早診斷對(duì)防控梅毒意義重大。梅毒臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜,需依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)以明確診斷,其中以血清學(xué)方法為主,尤其是檢測(cè)特異性Tp抗體。最早以Tp全菌作為診斷抗原,但獲取Tp抗原困難,且與其他密螺旋體有交叉抗原。近十余年來(lái),基于重組診斷抗原的血清學(xué)方法大力促進(jìn)了特異、快速、精準(zhǔn)的梅毒血清學(xué)診斷的發(fā)展。但目前應(yīng)用的重組抗原仍不能有效診斷早/晚期梅毒,或區(qū)分不同感染階段,或療效判斷[1],需進(jìn)一步尋找其他抗原。本文綜述傳統(tǒng)重組Tp膜脂蛋白及部分新型候選抗原在梅毒診斷中的應(yīng)用價(jià)值及局限性,并進(jìn)一步討論最佳候選抗原的條件。

1 Tp分子生物學(xué)特征

1.1 基因組特征Tp無(wú)質(zhì)粒,染色質(zhì)基因組非常小。Tp全基因組同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)[2],Tp基因有約43%的開放性閱讀框(ORF)未找到與之匹配的數(shù)據(jù)庫(kù),可能為功能不明的新基因[3]。Tp缺乏多種參與代謝的酶類[4],體外培養(yǎng)困難,不能進(jìn)行基因操作,成為阻礙這些功能不明基因功能研究的主要瓶頸。

1.2 蛋白質(zhì)組與免疫蛋白質(zhì)組特征 先后應(yīng)用SDS-PAGE、二維凝膠電泳(2DGE)[5]及互補(bǔ)質(zhì)譜技術(shù)[6],發(fā)現(xiàn)Tp蛋白質(zhì)組主要特征有:Tp外膜蛋白密度非常低(僅為大腸埃希菌外膜蛋白的1%),主要包括有種特異性、由12種蛋白組成的Tpr蛋白家族,以及一些暴露于膜表面的蛋白(最初以TROMPs命名,現(xiàn)主要根據(jù)ORF序列來(lái)命名,如Tp0326、Tp0453)。此外,位于周質(zhì)間隙的鞭毛蛋白(傳統(tǒng)上被命名為Fla)在Tp中表達(dá)量非常高[7]。Tp還存在大量脂蛋白,大多位于Tp的細(xì)胞內(nèi)膜,脂蛋白基因表達(dá)水平也高[8]。

能夠引起宿主免疫應(yīng)答,并可與梅毒患者血清反應(yīng)的蛋白統(tǒng)稱為Tp免疫蛋白組。Brinkman[9]與McGill[5]應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組技術(shù),分別從Tp重組蛋白表達(dá)文庫(kù)和感染兔睪丸獲取的Nichols株天然蛋白中,僅檢測(cè)到了30余種免疫活性抗原。2個(gè)研究發(fā)現(xiàn)的免疫反應(yīng)性蛋白雖不完全相同,但主要蛋白一致,主要包括一些通?？膳c不同期梅毒患者血清反應(yīng)的內(nèi)膜脂蛋白。該類脂蛋白未暴露于膜表面,但仍可引起高水平的抗體應(yīng)答,所以均可用做梅毒的診斷抗原,極大地豐富了Tp特異性血清學(xué)檢測(cè)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),Tp免疫蛋白質(zhì)組中很少有位于膜表面的抗原,這限制了對(duì)Tp的檢測(cè)。2個(gè)研究中免疫蛋白質(zhì)組結(jié)果雖不同,但外膜蛋白在免疫診斷中的價(jià)值引起了學(xué)者們的興趣?？傊?免疫蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)表明了Tp免疫原性低,同時(shí)也列舉了最具前景的梅毒診斷抗原。

2 重組Tp診斷抗原的基本功能與應(yīng)用及局限性

2.1Tp膜脂蛋白診斷抗原 檢測(cè)特異性Tp抗體最初以天然或經(jīng)超聲破碎的Tp細(xì)胞作為診斷抗原,目前仍用于熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(FTAABS)、密螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)等試劑盒中。由于Tp無(wú)法在體外連續(xù)培養(yǎng),獲取其抗原困難,而且與其他密螺旋體有交叉抗原。近年來(lái),重組蛋白技術(shù)極大地促進(jìn)了Tp血清學(xué)診斷的發(fā)展。通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)的重組蛋白作為診斷抗原,用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或者蛋白印跡法(WB)等測(cè)定特異性Tp抗體。

最早用作重組診斷抗原的是Tp內(nèi)膜脂蛋白Tp15(tp0171基因產(chǎn)物)、Tp17(tp0435基因產(chǎn)物)與Tp47(tp0574基因產(chǎn)物),三者均具強(qiáng)免疫原性。Tp15功能仍不明;Tp17為β-桶狀蛋白[10],在維持膜結(jié)構(gòu)、通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)黏附分子、趨化因子等方面起重要作用[11]。Tp47是一種羧肽酶(青霉素結(jié)合蛋白),能促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)以及誘導(dǎo)血管間黏附分子[12]。早期的Tp診斷基于單一的重組抗原,Tp15、Tp17和Tp47檢測(cè)的敏感性和特異性分別是100%、96%、100%和100%、100%、20%[13],而2種以上抗原組合可提高檢測(cè)敏感性,繼而建立了人工嵌合體脂蛋白Tp15-Tp17-Tp47,同時(shí)結(jié)合ELISA[14]和微型蛋白質(zhì)芯片技術(shù)[15],作為快速簡(jiǎn)便的梅毒血清學(xué)診斷方法。此外,重組脂蛋白還包括目前被用做診斷抗原的Tmp A(tp0768基因產(chǎn)物)[16]和 Tpp15-Tpp17-Tp44.5-Tp47融合抗原(Meridian Life Science,Inc.,Memphis,Tennessee USA)。少數(shù)應(yīng)用TmpC(tp0319基因產(chǎn)物,嘌呤核苷受體脂蛋白)[17]與MglB-2(tp0684基因產(chǎn)物,甲基半乳糖苷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)做診斷抗原[18]。脂蛋白的抗原組合用于免疫印跡(WB)中,顯示出高度敏感性和特異性[19]。

最新發(fā)現(xiàn)的Tp32脂蛋白 (tp0821基因產(chǎn)物)是一種結(jié)合L-甲硫氨酸的Tp內(nèi)膜脂蛋白[20]。該蛋白在Brinkman[9]和McGill[5]的研究中無(wú)明顯免疫反應(yīng)性,但Xie等[20]結(jié)果顯示出IgM和IgG的陽(yáng)性率分別高達(dá)91.0%和98.3%,與其他方式的檢測(cè)結(jié)果一致。以重組Tp0821與萊姆病、鉤端螺旋體病患者以及健康人群血清交叉反應(yīng)的特異性為94.3%～100%,提示Tp0821經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證后可作為一類新型的梅毒診斷抗原[20]。

總之,基于重組脂蛋白技術(shù)的Tp特異性抗體檢測(cè)能使梅毒診斷的特異性和敏感性達(dá)95%～99%,但對(duì)早、晚期梅毒診斷[21]以及療效判定不太有效,也不能區(qū)分梅毒所處的感染階段,而免疫蛋白質(zhì)組研究結(jié)果表明,在感染期間可能針對(duì)某些Tp抗原產(chǎn)生不同免疫應(yīng)答。因此,必須擴(kuò)大范圍尋找用于梅毒各個(gè)感染時(shí)期的診斷抗原。

2.2Tp表面暴露蛋白診斷抗原 外膜蛋白是最重要的免疫靶標(biāo),但Tp外膜蛋白含量非常少,在Cox的研究中[22]僅確定了17個(gè)候選外膜蛋白,包括7個(gè)Tpr家族成員、9個(gè)非Tpr假定蛋白以及Tp0326(Tp92)蛋白。

Tpr家族蛋白包含了12個(gè)蛋白,分為3個(gè)亞族。亞族Ⅰ(TprC、Tpr D、TprI、Tpr F)在C端、N端以及中央?yún)^(qū)域有保守序列,預(yù)測(cè)大多位于外膜,與膜的滲透性有關(guān)。亞族Ⅱ(Tpr E、Tpr G、TprJ)有共同的N端和C端,中間為序列與長(zhǎng)度不等的中央?yún)^(qū)域。亞族Ⅲ(Tpr A、TprB、Tpr H、Tpr K、Tpr L)同源性較低,有不同的可變區(qū),其中Tpr K(tp0897基因產(chǎn)物)有7個(gè)可變區(qū),該區(qū)是抗體重要的應(yīng)答靶位,但由于高度異變使Tp逃脫免疫清除[23]。出人意料的是,盡管針對(duì)亞族Ⅰ的Tpr蛋白及Tpr K的N端保守區(qū)能產(chǎn)生很強(qiáng)的抗體和T細(xì)胞應(yīng)答,但在Brinkman[9]和McGill[5]的免疫蛋白質(zhì)組研究中均未顯示出免疫反應(yīng)性,這可能與上述Tpr蛋白的變異性有關(guān),尤其是Tpr K?；谠赥p致病及免疫逃逸中的重要作用,Tpr蛋白家族可用作Tp候選疫苗抗原,但作為診斷抗原具有一定限制性[1]。

非Tpr家族的表面暴露的密螺旋體稀有外膜蛋白稱為TROMPs,包含 TROMP-1(31-k Da)、TROMP-2(28-k Da)及TROMP-3(65-k Da)。在先前的研究中TROMPs和感染兔及梅毒血清反應(yīng)[24],而Brinkman[9]研究中TROMP-2(Fla A同系物,tp0663基因產(chǎn)物)僅和一期梅毒血清反應(yīng)。在McGill[5]的Tp蛋白組研究中首次確定了TROMPs蛋白,但WB試驗(yàn)未顯示出其與梅毒血清反應(yīng)。目前,Tp0663被確定為新的血清診斷候選抗原,其對(duì)于檢測(cè)不同階段的梅毒感染具有高度敏感性(98.83%)和特異性 (100%)[25]。

Tp0326(Tp92)也稱為Bam A,為膜表面蛋白,與革蘭氏陰性家族高保守的β-桶狀復(fù)合物序列同源[26],其N端有多肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(POTRA),C端有β桶狀結(jié)構(gòu)[26]。Brinkman研究中Tp0326顯示免疫反應(yīng)性[9],但McGill研究中[5]卻不與潛伏期梅毒血清反應(yīng),也無(wú)免疫原性,這是因?yàn)門p0326在Tp蛋白組中表達(dá)量非常少,針對(duì)POTRA與β-桶狀結(jié)構(gòu)部分2個(gè)表位產(chǎn)生的抗體很少。出人意料的是,Tp感染兔血清均可與這2個(gè)表位反應(yīng),而人類二期梅毒血清僅對(duì)POTRA反應(yīng)[25]。最近,Luthra[27]研究結(jié)果表明Tp0326的β桶狀結(jié)構(gòu)域只有在完整的Tp中才有表面暴露的抗原表位。根據(jù)這些結(jié)果,基于重組Tp0326、Tp0326與Tp0453組合、Tp0326-0453融合蛋白的梅毒診斷試劑盒已經(jīng)被開發(fā)[28]。

Tp0453蛋白為穿孔蛋白(假想的脂蛋白),位于Tp外膜的內(nèi)表面,參與脂質(zhì)與糖脂運(yùn)載。Brinkman研究中Tp0453無(wú)血清反應(yīng)性[9],但McGill研究中顯示出能與一期梅毒血清反應(yīng)[5],這個(gè)結(jié)果與Van Voorhis數(shù)據(jù)一致[29]:當(dāng)其與梅毒血清反應(yīng)時(shí)顯示出100%特異性與100%敏感性,而不與回歸熱、萊姆病或鉤端螺旋體病患者血清發(fā)生交叉反應(yīng)。最近,通過(guò)p ET28a載體表達(dá)得到可溶性Tp0453,基于Tp0453的ELISA診斷試劑盒亦可獲得?；谥亟MTp0453及Tp0453-Tp0326融合蛋白的ELISA方法也有報(bào)道,兩者的敏感性和特異性分別為98%和98%、100%和99%,這些蛋白均為可用于梅毒血清學(xué)診斷的新型候選抗原[28]。目前包含Tp0453與傳統(tǒng)的Tp15、Tp17、Tp47、Tmp A和新型Gpd(Tp0257)抗原的WB試劑盒Recom Blot Treponema IgG/IgM 2.0(Mikrogen Gmb H,Germany)已實(shí)現(xiàn)商品化。

2.3Tp黏附素、周質(zhì)蛋白、鞭毛蛋白診斷抗原Tp0155和Tp0483蛋白是Tp的假定黏附素,能結(jié)合纖粘蛋白,但兩者在免疫蛋白組研究中[5,9]并未表現(xiàn)出血清反應(yīng)性。在與一期梅毒早期感染血清反應(yīng)時(shí),均僅有9%的患者血清顯示出陽(yáng)性結(jié)果[29]。

Tp0136是暴露于Tp膜外的假定黏附素/脂蛋白,能結(jié)合纖粘蛋白和層粘連蛋白。相比細(xì)胞纖維蛋白,Tp0136更能有效通過(guò)其N端保守區(qū)域與血漿纖維蛋白結(jié)合[30]。當(dāng)宿主對(duì)Tp應(yīng)答時(shí),Tp0136轉(zhuǎn)錄水平很高,可能對(duì)Tp持久存活起重要作用。Tp0136在McGill蛋白組研究中無(wú)免疫反應(yīng)性[5],而在Brinkman研究中主要對(duì)一期梅毒血清有反應(yīng)[9]。楊珺等[31]表達(dá)分子量為28kDa的可溶性Tp0136活性肽段(Tp0136B),與早期梅毒血清反應(yīng)的陽(yáng)性率為85.5%,在一期梅毒診斷中有良好的前景。

Tp0751是Tp重要黏附素,能結(jié)合層連蛋白,也是Tp金屬蛋白酶。與其共轉(zhuǎn)錄的Tp0750是一種絲氨酸蛋白酶,能降解凝塊組分(纖維蛋白原和纖連蛋白)[32],被預(yù)測(cè)和Tp0751一起發(fā)揮作用,與Tp入侵宿主和體內(nèi)播散有關(guān)。盡管Tp0751與Tp致病性有關(guān),但其在上述的2個(gè)免疫組蛋白實(shí)驗(yàn)中并未顯示出反應(yīng)性,在Brinkman研究中[9],對(duì)早期潛伏期梅毒血清僅表現(xiàn)出輕微反應(yīng)性。在一項(xiàng)比較性研究中,相比Tp0257(Gpd)以及Tp1038(Tp F1),Tp0751表現(xiàn)出了更低的血清反應(yīng)性[28]。雖然在診斷方面有局限性,但它顯示出了很好的免疫保護(hù)性,有希望成為一種梅毒候選疫苗分子[33]。

Tp0257(Gpd)與許多病原體的甘油磷酸二酯酶蛋白家族同源,可水解脫?；字?起初被認(rèn)為暴露于外膜表面,但進(jìn)一步研究表明為周質(zhì)間隙多肽。在Brinkman[9]研究中,Tp0257能與一期、二期及早期潛伏期梅毒血清反應(yīng),但McGill研究中未檢測(cè)到該蛋白[5]。目前僅有少量關(guān)于重組Tp0257和Tp0453一起用于梅毒血清檢測(cè)的數(shù)據(jù)報(bào)道[29]。

Tp1038(Tp F1,4D抗原)與鐵元素的吸收有關(guān)系,屬細(xì)菌鐵蛋白[34]。在Brinkman[9]研究中,Tp1038能與潛伏期梅毒血清反應(yīng),在McGill[5]研究中,其寡聚體能與所有期的梅毒血清反應(yīng),而單體則不能。Jiang等[34]研究表明,重組Tp1038對(duì)所有期的梅毒血清都表現(xiàn)出很高的靈敏性(93.3%～100%),交叉反應(yīng)顯示出極高的特異性(100%),被認(rèn)為是一種非常有前景的梅毒診斷候選抗原。

Tp0965為膜融合蛋白,位于Tp周質(zhì),能激活內(nèi)皮細(xì)胞,增加單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[36]。Tp0965在McGill研究中能與各期梅毒血清反應(yīng),有潛在的診斷價(jià)值。Long等[37]發(fā)現(xiàn)重組Tp0965能與臨床各期梅毒血清反應(yīng),表現(xiàn)出良好的敏感性與特異性。Runina[38]發(fā)現(xiàn)重組Tp0965檢測(cè)各期梅毒總的敏感性與特異性分別為98.8%和87.5%,對(duì)一期與早期潛伏梅毒的敏感性非常高(達(dá)100%)。這些結(jié)果提示Tp0965也是一種非常有前景的新型梅毒診斷候選抗原。

鞭毛蛋白是Tp的重要抗原,由軸絲核心蛋白Tp0868(FlaB1)、Tp0792(FlaB2)和 Tp0870(FlaB3)、鞘蛋白Tp0249(Fla A1)、鉤狀基復(fù)合蛋白(Tp0398和Tp0727)及馬達(dá)蛋白 (Tp0400)構(gòu)成。Tp0398和Tp0727在Brinkman[9]研究中有血清反應(yīng)性,Mc Gill[5]結(jié)果也表明大部分鞭毛蛋白能與所有期的梅毒血清反應(yīng)。早期研究發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白與螺旋體屬的很多蛋白有交叉反應(yīng),這限制了其在梅毒診斷中的應(yīng)用。Jiang等[39]以重組FlaB1、FlaB2與FlaB3檢測(cè)相應(yīng)IgG有很高的敏感性和特異性,分別達(dá) 95.4%、98.9%、92.6% 和 95.8%、95.1%、95.8%,檢測(cè)一期梅毒和先天性梅毒相應(yīng)的IgM敏感性和特異性分別為76.8%和83.1%、72.0%和87.7%、74.4%和89.2%,表明三者也可作為梅毒血清學(xué)診斷的候選抗原。為提高特異性,最近Tan等[40]構(gòu)建Tp的FlaB1、FlaB2和Fla B3保守的N端、C端及中間可變區(qū)M肽段,ELISA檢測(cè)臨床標(biāo)本特異性IgG,發(fā)現(xiàn)FlaB3的M肽段(B3M)的敏感性和特異性最高,分別為95%和100%,是有希望的候選抗原。

總之,新型重組抗原在梅毒血清學(xué)診斷中具有潛在價(jià)值,但也存在局限性。例如,某些蛋白 (如Tp0136、Tp0257和Tp1038)對(duì)一期和早期梅毒檢測(cè)更有價(jià)值;相對(duì)傳統(tǒng)的Tp免疫優(yōu)勢(shì)脂蛋白,有些蛋白的敏感性(如Tp0155、Tp0483、Tp0751)和特異性(如Tp0868、Tp0792、Tp0870)較低[1]。

3 Tp診斷抗原未來(lái)的發(fā)展方向

目前的研究表明,很多有望成為提高梅毒血清學(xué)診斷效果的新型候選抗原的實(shí)際檢測(cè)效果遠(yuǎn)不如傳統(tǒng)重組脂蛋白,開發(fā)新的Tp重組抗原尤為必要?？煽紤]應(yīng)用以下策略:針對(duì)Tp感染過(guò)程中可改變自身生物學(xué)行為、在不同感染時(shí)期形成不同的蛋白表達(dá)譜的特點(diǎn),應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)(如非標(biāo)定量Label-free質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合免疫印跡)等方法技術(shù),以不同感染階段的梅毒患者或感染兔血清篩選某一特定梅毒階段(如早期或晚期或治愈后梅毒)表達(dá)的抗原,以其作為該階段的生物標(biāo)記物檢測(cè)相應(yīng)抗體。篩選理想診斷抗原應(yīng)符合以下條件[1]:①可檢測(cè)的免疫反應(yīng)性;②在不同梅毒感染階段的表達(dá)水平;③感染消除后免疫應(yīng)答水平下降。通過(guò)定量與定性分析其相應(yīng)抗體水平,可早期診斷和區(qū)分不同感染階段的梅毒,判斷梅毒治療效果,同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用重組抗原(多價(jià)融合蛋白或多價(jià)表位多肽)以提高檢測(cè)的敏感性和特異性[41]。最近,Liu等[42]應(yīng)用生物信息學(xué)分析和兔感染模型鑒定出Tp0971、Tp0768、Tp0462為感染依賴性抗原(Tp在早期感染機(jī)體階段合成分泌到菌體胞內(nèi)外的蛋白抗原),分別基于此3種抗原的ELISA方法均與商品化TPPA和Tp-ELISA試劑盒有很好的一致性,而分析隨訪梅毒患者Tp0971抗體與RPR滴度變化的相關(guān)性表明,Tp0971有希望用于梅毒療效的檢測(cè)。

梅毒血清學(xué)診斷的發(fā)展速度已經(jīng)放緩,但發(fā)展Tp重組抗原仍然是多學(xué)科生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域面臨的實(shí)際任務(wù),需要開展大量的實(shí)驗(yàn)室工作和臨床工作。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:王斯倩,符波,趙宇龍,等.重組梅毒螺旋體診斷抗原的研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):837-842.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.116