擴張型心肌病動物模型研究概述

劉舜禹，王振濤，吳 鴻,2

(1.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450006； 2.河南省中醫(yī)院，鄭州 450002)

擴張型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)是一種心肌異質性疾病，主要特征是左心室擴張，并伴有收縮功能障礙。舒張功能障礙和右心室功能受損也可兼有發(fā)生。本病呈進行性加重，繼而可誘發(fā)心力衰竭、惡性心律失常和猝死等不良事件[1]。如今DCM患病率有逐年升高的趨勢，對人類健康造成了嚴重威脅，而建立合適的動物模型是實驗研究的重要基礎。我們對本病動物模型的造模方法進行匯總及評價分析，為進一步研究提供基礎。

DCM根據(jù)病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種，原發(fā)性心肌病主要由局限于心肌病變；繼發(fā)性心肌病則是由全身或多器官疾病而引起的心肌損害。因繼發(fā)性心肌病涉及多器官損害，病理生理相對復雜，在動物模型中，我們一般選擇原發(fā)性病因所致的動物模型。我們依照病因的差異，將目前常見的造模方法進行歸納總結，可初步將其分為家族遺傳性、免疫性、病毒感染性、酒精性、藥物毒性、心動過速性及其他方法等。

1 家族遺傳性

家族性擴張型心肌病(family dilated cardiomyopathy, FDCM)約占到所有DCM患者的30%-48%。相比與其他病因，F(xiàn)DCM有著相對獨特的病理生理特點。目前研究的結果顯示，DCM的致病基因復雜多樣，有超過40種基因與DCM有關，同時也存在著多種基因突變，多種遺傳方式復合的情況。這些致病基因編碼多種蛋白，目前已知突變基因編碼集中兩種主要的蛋白質亞群——肌小節(jié)蛋白(sarcomeric protein)和細胞骨架蛋白(cytoskeletal protein)上。在此基礎上，近年來通過各種基因修飾方法制備出一系列DCM動物模型。

1.1 肌小節(jié)蛋白(sarcomeric protein)

肌小節(jié)作為心肌細胞的基本結構，由粗肌絲和細肌絲構成，被兩條Z線分割，對心肌收縮與舒張的能力至關重要。細肌絲主要由原肌球蛋白(tropomyosin)、肌動蛋白(cardiac actin)、肌鈣蛋白(cardiac troponin)組成，而粗肌絲主要包括β肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain,β-MHC)及肌球蛋白結合蛋白C(cardiac myosin binding protein-C,MyBP-C)等。編碼肌絲蛋白及Z線結構蛋白的基因突變都有可能導致心肌細胞的結構與功能異常，從而導致DCM發(fā)生。Lynn等[2]發(fā)現(xiàn)在殘基230位置，天冬氨酸取代天門冬氨酸，導致α-原肌球蛋白(α-tropomyosin)編碼基因突變。從而成功制備出D230N轉基因小鼠模型。小鼠在2月齡時出現(xiàn)嚴重的收縮功能障礙，且無明顯炎癥及纖維化表現(xiàn)，符合早發(fā)性DCM特征。ACTC(E361G)突變能降低機體對腎上腺素能刺激的反應，導致心肌儲備減少，從而產生應激下的收縮功能障礙，引發(fā)DCM。Wilkinson等[3]在ACTCE361G突變模型小鼠中發(fā)現(xiàn)左室舒張末內徑較空白對照組增加15%，心肌收縮力減弱，同時相比于其他基因突變模型，有更高的造模成功率及生存率。心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T, CTnT)目前已知有多種突變體，近年來多篇文獻報道了采用CTnTΔK210突變小鼠模型[4-6]，而在國內，馮娟等[7]構建CTnT(R141W)轉基因DCM小鼠模型，該模型具備明顯的全心擴大，間質纖維化以及心肌收縮力下降等特點。4月齡后小鼠出現(xiàn)早期死亡,至8月齡早期死亡率達11.1%。MYL2基因可編碼心肌肌球蛋白調節(jié)輕鏈(regulatory myosin light chain, MYLC)，Barefield等[8]利用重組調節(jié)輕鏈突變體(regulatory light chain, D94 A-RLC)制備小鼠模型。突變改變肌球蛋白絲結構及與肌動蛋白絲相互作用來減弱心肌收縮能力。模型小鼠射血分數(shù)下降，進而演變成DCM。肌球蛋白結合蛋白C基因(cardic myosin binding protein C, MYBPC)突變往往導致收縮功能障礙及心肌細胞損傷，Lynch等[9]采用三月齡純合子MYBPC3基因突變小鼠，可明顯觀察到小鼠心臟收縮功能障礙，細胞損傷和心室重塑。Gramlich[10]通過同源重組技術，將突變的Titin蛋白基因，植入小鼠胚胎干細胞，發(fā)現(xiàn)純合突變體在胚胎形成期肌小節(jié)發(fā)育異常而發(fā)生死亡，通過培育雜合突變體的DCM模型。

1.2 細胞骨架蛋白(cytoskeletal protein)

細胞骨架蛋白在維持細胞形態(tài)及細胞內部結構的秩序中起重要作用,染色體2q35上的結蛋白(desmin)基因突變能夠導致多種蛋白聚集性肌病和心肌病。Clemen等[11]通過模擬人類常見的結蛋白突變R350P基因，制備出同源R349Pdesmin基因敲入小鼠。小鼠隨著年齡增長，出現(xiàn)骨骼肌無力、心臟擴大以及心律失常等癥狀。δ-sarcoglycan (Sgcd)基因突變是導致肢帶型肌營養(yǎng)不良癥的重要誘因。在Sqcd轉基因大鼠中，隨著年齡增加，心臟顯著擴大，同時也有骨骼肌纖維化、核聚集，血清肌酸激酶升高等特點[12]。杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是由X染色體上肌萎縮蛋白DMD基因突變引起的肌營養(yǎng)不良。營養(yǎng)不良多可累及心肌，從而導致DCM。通過轉基因技術，制備肌萎縮蛋白(dystrophin)缺失模型，可在多種動物模型如犬[13]、豬[14]、小鼠[15]等檢測的心臟擴大，但應用于SD大鼠模型中，效果較為穩(wěn)定，Larcher等[16]通過TALENs靶向外顯子23制備DMD突變大鼠，7月齡時出現(xiàn)心臟擴大并伴有壞死和纖維化改變。

1.3 核纖層蛋白(lamin)

核纖層蛋白是細胞核中間絲狀體網絡結構構成的主要部分，它支撐和保護了細胞核及其他核蛋白的正常功能。現(xiàn)有研究稱，Lamin A/C蛋白基因突變而導致的核膜蛋白編譯錯誤也是發(fā)病重要誘因；目前針對Lamin A/C基因LMNA已經報道了數(shù)個基因系小鼠心肌病模型[17-19]，其中，攜帶H222P錯義LMNA基因突變的敲入小鼠模型與人類受試者心臟病理較為吻合。Arimura等[20]通過觀察，發(fā)現(xiàn)模型小鼠，心肌纖維化加重，心臟傳導系統(tǒng)缺損，肌營養(yǎng)不良增加。

1.4 線粒體心肌病

線粒體心肌病主要是因線粒體能量合成系統(tǒng)功能障礙所引起的心肌結構和(或)功能異常。錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)是一種重要的線粒體抗氧化酶，MnSOD缺乏癥可導致嚴重的線粒體損傷。Oyama等[21]將小鼠MnSOD基因特異敲除，表現(xiàn)出典型的DCM特征。內膜50轉位酶(TIM50)是線粒體內膜復合物轉位酶的成員之一，Tang[22]發(fā)現(xiàn)TIM50在DCM患者心臟表達下降，用TIM50基因敲除小鼠驗證DCM模型。超長鏈?；o酶A脫氫酶 (very long chain Acyl-CoA dehydrogenase deficiency, VLCAD) 是催化線粒體氧化的第一步，VLCAD基因突變是導致遺傳性長鏈脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)障礙的主要原因。VLCAD敲除小鼠顯示出左室內徑增加、低體溫及心動過緩[23]。

除此之外，Mst1是Hippo信號級聯(lián)中調節(jié)細胞凋亡和增殖的核心激酶，在DCM患者的心臟組織中，可檢測到該信號被激活。通過轉基因過表達Mst1基因建立小鼠DCM模型[24]，可檢測到心腔擴張，左室射血分數(shù)降低，左室收縮性和舒張性變差，左室膠原含量增加，纖維化增加。

家族遺傳性動物模型是目前DCM動物模型的，相比其他造模方法，避免了灌胃、手術等操作對動物的損傷干擾，也更大程度的還原了臨床DCM的病因特點。除上述基因外，仍有許多與本病相關未知的基因有待發(fā)掘，也存在著根據(jù)人類DCM發(fā)病相關基因在動物模型上復制未成功的情況。不同基因突變模型在病理特點及機制上也有著比較大的差別，可表現(xiàn)在發(fā)病時間、死亡率及相關并發(fā)癥等方面。我們在選擇實驗動物時，也應根據(jù)實驗目的及治療方案有針對性選擇。

2 病毒性

病毒感染與DCM關系密切，有觀點認為病毒性心肌炎與DCM是同一疾病的不同發(fā)展階段， DCM是病毒性心肌炎的終末期。目前已知有多種病毒，主要包括腸道病毒、腺病毒、巨細胞病毒、流感病毒等與DCM有關。

反復柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)感染是難治性心肌炎最重要的病因，也是導致慢性心肌炎遷延為DCM重要病因。李雙杰等[25]用CVB3反復感染Balb/c小鼠，發(fā)現(xiàn)感染病毒3個月內組織病理學特征與慢性心肌炎類似，而3個月后則呈現(xiàn)出典型的DCM病理特征。也一些研究者發(fā)現(xiàn)，通過對接種次數(shù)及劑量的改變，能夠減少小鼠病死率，縮短造模時間[26]。近年來，細小病毒B19 V常見于DCM患者心肌內膜活檢標本中，Bogomolovas等[27]經腹腔注射該病毒血清，經過69天后，可以觀察到明顯射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)下降及左室舒張末內徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)增大。病毒接種模型后，在心肌細胞中存在著凋亡、自噬、壞死、程序性壞死等多種方式，最終導致心肌損傷，發(fā)展成DCM。相比于其他造模方法，病毒接種造模周期較長，同時研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有品系的動物都對病毒存在易感性，Balb/c小鼠較其他品系小鼠對柯薩奇病毒較為敏感，是目前最常用的模型。

3 免疫性

一般認為，自身免疫機制可能在病毒感染等多種因素下被激活，反應造成了包括未感染心肌細胞在內的非選擇性溶解。機體通過自身抗原促發(fā)免疫機制，再加上輔助因子的刺激，從而發(fā)生自身免疫，引起心肌損害。

自身免疫性心肌病表現(xiàn)為除常見的DCM病理性變化外，還可觀測到心肌血清中抗肌球蛋白抗體和IgG的增高，以及心肌局部中性粒細胞、T細胞和巨噬細胞的浸潤。Kodama等[28]將含豬心肌肌凝蛋白乳化液注射于大鼠腳墊皮下，28 d后采用超聲心動圖和心肌病理切片證實DCM大鼠模型成功。閆紅梅等[29]通過注射背部多點皮下注射心肌肌球蛋白，刺激細胞毒性T細胞增殖、激活巨噬細胞等，起到致炎作用。21 d后心臟超聲提示小鼠LVEF降低、LVEDD、LVEDs明顯增大，并有單核細胞浸潤、少量心肌纖維化產生。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)作為一種常見的炎性因子，通過轉基因技術使TNF-α在小鼠心臟特異性過表達，促發(fā)自身免疫應答，可以使小鼠從4-12周時逐漸發(fā)展成左室擴張，同時隨著年齡增加，肌原纖維膠原含量也有著顯著變化[30]。

免疫性誘導的動物模型主要分為外源抗原誘導型和轉基因自發(fā)型，該方法有造模成功率高，造模時間相對較短等優(yōu)點，但在具體操作中，技術相對復雜。DCM免疫調節(jié)治療是目前研究的重要方向之一，優(yōu)化動物模型則是研究的重要基礎。

4 酒精性

長期攝入大量酒精是引起酒精性心肌病(alcoholic cardiomyopathy，ACM)的重要因素之一。乙醇在體內代謝而產生的乙醛被認為是導致ACM的最主要因素。相關研究發(fā)現(xiàn)ACM可能與氧化應激、營養(yǎng)失衡等多種機制有關。Kryzhanovskii等[31]應用10%乙醇溶液代替水喂養(yǎng)大鼠；平均每日乙醇消耗量為5.0～6.5 g/kg，喂養(yǎng)24周，能夠檢測到心臟的肌力功能下降，左右心室擴張。Guo等[32]通過制備轉基因乙醇脫氫酶-2 (alcohol dehydrogenase-2,ADH-2)過表達小鼠，3月齡時開始給予4%乙醇飲食喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)8周。ADH過表達小鼠與同樣乙醇飲食的野生小鼠相比，心臟超聲顯示，LVEDd增大，LVEF降低更為明顯。

酒精性與其他病因相比較為特殊，病理生理特點也有所差異，主要體現(xiàn)在心室肥厚及纖維化改變上，同時，未做其他處理，單純采用酒精飼養(yǎng)的小鼠造模周期較長，在研究中，我們應當慎重選擇此方法制備DCM動物模型。

5 藥物毒性

阿霉素，又名多柔比星(doxorubicin, Dox)是臨床上常見的廣譜抗腫瘤藥，具有強烈的細胞毒性作用。應用多柔比星制備DCM動物心衰模型有著操作簡便，費用低廉，模型穩(wěn)定等特點，是目前常用的造模方法，目前大多數(shù)研究者采用2 mg/kg 每周一次，腹腔注射，注射6～8周的方案制備動物模型。有學者通過改變用藥劑量、用藥途徑、動物品種等方式進一步提升造模成功率，減少模型死亡率[33]。

柔紅霉素(daunorubicin)其作用與阿霉素相同，能損傷DNA，抑制RNA和DNA的合成，Talavera等[34]研究發(fā)現(xiàn)應用家兔靜脈注射柔紅霉素4 mg/kg/周(6周)比阿霉素2 mg/kg/周(8周)的方案有著更高的DCM模型成功率，同時早期致死率也有所下降，其他器官損害減輕。

呋喃唑酮(furazolidone, FZD)是一種硝基呋喃類抗生素，可用于治療細菌和原蟲引起的痢疾、腸炎、胃潰瘍等胃腸道疾患。早期發(fā)現(xiàn)其可導致火雞心室擴大，而逐步運用于DCM動物模型的制備中，現(xiàn)多認為其致病機制可能與兒茶酚胺毒性有關?，F(xiàn)多采用0.15 mg/g灌胃，每天給藥1次，連續(xù)喂飼 8 周灌胃[35]或自飲水(1 kg水加700 mg呋喃唑酮)飼養(yǎng)[36]的方法，技術相對簡便，費用較為低廉。

異丙腎上腺素(isoprenaline, ISO)能夠對心臟β1受體具有強大的激動作用，能夠激活交感神經系統(tǒng)，導致心室重構，通過間斷皮下注射ISO，隨著用藥劑量增加，可檢測到左室充盈壓升高和心室擴張。逐漸出現(xiàn)心肌纖維化及心功能下降等特點[37]。

毒性藥物法是目前實驗研究中采用最為普及的造模方法，具有操作簡便，造模周期較短，費用低廉，模型穩(wěn)定等特點，但不同藥物的作用機制有著較大差別，應用中應根據(jù)檢測的相關指標及干預方法選擇適合的造模方法。

6 心動過速性

心動過速可以引起的心輸出量下降以及神經內分泌系統(tǒng)異常激活等病理生理變化，從而促進心肌重構和心衰的發(fā)生發(fā)展。組氨酸豐富鈣結合蛋白(histidine rich calcium binding protein, HRC)是一種的肌漿網調節(jié)器，能夠調節(jié)Ca2+的吸收、儲存和釋放。HRC-Ser96Ala突變可導致鈣處理功能受損，從而觸發(fā)惡性心律失常的發(fā)生，這被認為是DCM患者發(fā)生室性心律失常的主要機制。通過相關檢測證明HRC-Ser96Ala基因突變小鼠與右室心律失常型心肌病病理狀態(tài)較為吻合[38]。應用起搏裝置進行快速心室起搏法是一種較為安全，成功率高的造模方法，但一般應用于如犬[39]、豬[40]等大型動物體內。最近，Hulsmans等[41]設計出一種迷你可編程起搏器，置入小鼠體內后，以每分鐘750次起搏心室，持續(xù)4周，可檢測到心功能下降，但心臟擴張相比于大型動物并不明顯，該方案也有待進一步研究。

應用起搏裝置進行快速心室起搏是心動過速心肌病動物模型中應用最多的方法，具有成功率高，耗時短等優(yōu)點，但因為裝置復雜，一般應用于大型動物，模型造價較高不便于較大規(guī)模的研究擴展。臨床中惡性心律失常誘發(fā)的DCM多數(shù)與基因突變有關，通過基因技術誘導心律失常是我們未來研究的方向之一。

7 其他

心力衰竭是DCM的主要臨床表現(xiàn)，DCM心力衰竭的病理機制與其他原因導致的心力衰竭有著許多相似之處，結合我們所研究的病理生理環(huán)節(jié)不同，也可以酌情選擇其他誘因心衰模型進行研究。

缺血性損傷和心肌梗死是臨床中導致心衰的首要誘因，通過冠脈結扎或冠脈內注入微栓子，從而誘發(fā)心肌缺血，進一步發(fā)展為心室重構及心力衰竭。造模動物通常以大鼠為主，也可以選擇其他大型哺乳動物，同時模型制備方法及相關流程得到了不斷改進和優(yōu)化[42]，是目前較為成熟的一種造模方法。

主動脈狹窄是誘發(fā)心力衰竭的重要誘因，研究者一般通過手術造成主動脈狹窄，從而引起左室后負荷增加，模型大鼠逐漸出現(xiàn)代償性的左室肥厚，僵硬度增加以及舒張功能的減弱。經過12周至18周的培育，也可出現(xiàn)左室擴大，室壁變薄等病理改變[43]。

心肌缺血多通過心肌能量代謝障礙從而影響心臟結構及功能障礙，心肌梗死主要通過心肌細胞變性壞死及組織纖維化導致心功能下降，壓力負荷多通過激活神經內分泌系統(tǒng)，從而誘發(fā)心室代償性肥厚，逐漸失代償后出現(xiàn)室壁變薄，心室擴大，射血分數(shù)下降等特點。在我們應用這些模型來模擬DCM病理機制時，應當把握其病理生理演變規(guī)律，選擇合適的干預及觀測時間，同時應當注意避免檢測指標與造模方法原理有相悖之處。

8 討論

涉及本病的動物模型種類繁多，主要以大鼠、小鼠、家兔、豬、犬等哺乳動物為主。大鼠模型成本較低，飼養(yǎng)簡便，小鼠則是基因工程模型的常用選擇。家兔相較于大鼠，對阿霉素等藥物耐受性更好，有著更高的造模成功率及更低的死亡率。大型哺乳動物常被用于心動過速性及免疫性模型，同時存在著花費較高，難以飼養(yǎng)等特點。除了常見的哺乳動物模型外，果蠅[44]、斑馬魚[45]等也常被應用于轉基因或基因敲除DCM模型的研究中。DCM動物模型的造模方法雖然有很多，但是我們應當清楚的認識到，動物模型成功的關鍵在于體現(xiàn)出人類DCM的病理特點。針對動物模型心功能的評估通常包括心臟超聲和(或)心臟磁共振成像及有創(chuàng)的血流動力學檢測。以及。另外反應心臟功能的重要指標。除此之外，模型心臟的重量、形態(tài)及特征以及組織病理學、生化指標等證據(jù)，也為實驗提供堅實基礎。造模方法在能夠如實反應病理特點的基礎上，也應具備模型成功率高，可重復性強，病情發(fā)展相對可控，操作相對簡便、經濟等特點。隨著現(xiàn)在基因工程技術的發(fā)展和進步，我們可以預見到會在DCM動物模型相關研究中會有更多突破和進展，也加速了對本病發(fā)病機制和病理生理、促進相關藥物及療法的研究。