常用實驗小鼠感染諾如病毒后外周血免疫指標分析

李曉波，付 瑞，王 吉，王淑菁，李 威，王莎莎，秦 驍，黃宗文，賀爭鳴，岳秉飛*，趙德明

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100094； 2.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

小鼠諾如病毒(murine norovirus, MNV)目前在我國的實驗小鼠中有很高的感染率[1-2]，小鼠感染MNV后大多無任何臨床癥狀，但病毒可在體內(nèi)長期存在并通過糞便排毒，污染飼養(yǎng)環(huán)境，繼而感染其他個體[3]，我國的實驗動物國家標準目前還不要求對MNV進行檢測，因此很多實驗用的小鼠均為MNV陽性鼠。研究發(fā)現(xiàn)MNV感染129小鼠會致其脾中B細胞含量顯著增加[4]，129小鼠為免疫功能正常小鼠，表明MNV感染會使正常小鼠免疫功能發(fā)生改變。本研究選取國內(nèi)常用的KM，BALB/c，BALB/c-nu，C57BL/6及NIH等五個品系小鼠，對其感染MNV后外周血中的免疫細胞和細胞因子含量進行檢測分析，以評估對小鼠免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

五個品系的KM，BALB/c，NIH，C57BL/6及BALB/c-nu小鼠(體重分別為30～32 g,18～20 g,20～22 g,16～18 g及16～18 g)，SPF級，雌性，6周齡，每個品系各20只，購自國家嚙齒類實驗動物種子中心[SCXK(京)2014-0013]，動物實驗于中國食品藥品檢定研究院屏障動物實驗設(shè)施進行[SYXK(京)2017-0013]，本實驗所用水、鼠料及墊料均經(jīng)過滅菌處理，并按實驗動物的3R原則給予人道關(guān)懷，已通過福利倫理審查[IACUC號：中檢動(福)第2018(B)020號]。

1.1.2 病毒

小鼠諾如病毒BJ10-2062株(GenBank: KM458057)，TCID50為10-4.625/0.1 mL，本實驗室分離并保存。

1.2 主要試劑與儀器

FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD8a、PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45、APC anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD49b、細胞因子檢測試劑盒(LEGENDplexTMMulti-Analyte Flow Assay Kit)等均為BioLegend產(chǎn)品；RBC Lysing Solution(10×)購自Bio-Rad。流式細胞儀(美國BD公司，型號LSRII)；離心機(德國Hettich公司，型號MIKRO 22R)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及病毒的接種

每個品系小鼠分為感染組和對照組，每組各10只，感染組灌胃感染0.2 mL MNV病毒液，對照組灌胃0.2 mL的生理鹽水。分別于感染前(第0天)和感染后的第7、14、21、28天從眼周靜脈采集抗凝血，動物采血前于密封容器經(jīng)CO2麻醉5～8 s，每次采集大約200 μL，200 r/min離心10 min，分離血細胞及血漿。

1.3.2 免疫細胞的檢測

分離得到的血細胞，加入與血漿等體積的PBS重懸，每流式管中加入100 μL，按照檢測組合加入最佳反應(yīng)量的熒光標記抗體，混勻后室溫避光反應(yīng)20 min，每管加入用去離子水稀釋10倍的紅細胞裂解液工作液2 mL，混勻后室溫避光孵育10 min；1500 r/min離心5 min棄上清，加入PBS洗液(含1% FBS的PBS)2 mL混勻后1500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL PBS洗液，混勻后及時上機檢測，測定總T細胞(CD3+)、CD4+T細胞、CD8+T細胞、總B細胞(CD3-CD19+)、NK細胞(CD3-CD49b+)及NK-T細胞(CD3+CD49b+)占總淋巴細胞(CD45+)的百分比。

1.3.3 細胞因子檢測

反應(yīng)板每孔加100 μL洗液，室溫靜置1 min，倒棄，拍干，將標準品和待檢血漿樣品用稀釋液1∶2稀釋，每孔加50 μL，偶聯(lián)不同細胞因子捕獲抗體的熒光微球，渦旋振蕩30 s，每孔加25 μL，封板膜封好，鋁箔紙包裹避光，于振蕩器500 r/min室溫孵育2 h，每孔加200 μL洗液，真空抽濾吸干，洗滌2次。每孔加生物素標記的檢測抗體25 μL，封板膜封好，鋁箔紙包裹避光，于振蕩器500 r/min室溫孵育1 h，每孔直接加入25 μL鏈霉親和素-藻紅素(SA-PE)，封板膜封好，鋁箔紙包裹避光，于振蕩器500 r/min室溫孵育30 min。洗板后，每孔加150 μL洗液，振蕩器重懸微球1 min，在流式細胞儀讀取數(shù)據(jù)，測定IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL10及GM-CSF等13種細胞因子的含量。

1.3.4 結(jié)果分析

(1)感染組和對照組免疫細胞總體均值的比較：比較感染組和對照組感染MNV后第7、14、21、28天的總T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、總B細胞、NK細胞及NK-T細胞含量的總體均值。

(2)感染組和對照組細胞因子總體均值比較：比較感染組和對照組感染MNV后第7、14、21、28天的IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、CXCL10及GM-CSF共13種細胞因子的總體均值，結(jié)果以柱狀圖來表示。

(3)不同時間點免疫細胞百分比含量變化分析：根據(jù)感染MNV后第0、7、14、21、28天各時間點各群細胞的均值和標準差繪制曲線圖，分析各免疫細胞的變化趨勢。

(4)不同時間點細胞因子含量變化分析：繪制感染MNV后第0、7、14、21、28天五個時間點各細胞因子的含量均值和標準差的曲線圖，分析細胞因子含量的變化趨勢。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 感染組和對照組免疫細胞含量總體均值比較

KM小鼠感染組總T細胞及CD4+T細胞相比對照組均顯著升高(P<0.01)，總B細胞相比對照組顯著降低(P<0.01)，CD4/CD8比值相比對照組顯著升高(P<0.05)。CD8+T細胞、NK及NK-T細胞與對照組比差異均無統(tǒng)計學意義。BALB/c小鼠感染組CD8+T細胞相比對照組顯著降低(P<0.05)，其余指標兩組之間差異均無統(tǒng)計學意義。C57小鼠感染組相比對照組CD4+、CD8+T細胞均顯著降低(P<0.01，P<0.05)，總B細胞顯著升高(P<0.05)，其余指標差異均無統(tǒng)計學意義。NIH小鼠感染組總T細胞和CD8+T細胞相比對照組均顯著升高(P<0.01)，總B細胞顯著降低(P<0.01)，CD4/CD8比值顯著降低(P<0.05)，其余指標差異均無統(tǒng)計學意義。BALB/c-nu小鼠各群細胞差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

2.2 感染組和對照組細胞因子含量均值比較

KM小鼠感染組CXCL10的含量顯著低于對照組(P<0.01)，其余細胞因子含量比較無顯著統(tǒng)計學差異(圖1A)；BALB/c小鼠IFN-γ含量感染組顯著高于對照組(P<0.01)，其余細胞因子含量無顯著統(tǒng)計學差異(圖1B)；BALB/c-nu小鼠CCL2含量感染組顯著高于對照組(P<0.05)，TNF-α、CXCL1及CXCL10感染組含量均顯著高于對照組(P<0.01)，而IFN-β含量感染組顯著低于對照組(P<0.05)，其余細胞因子含量無顯著統(tǒng)計學差異(圖1C)；C57小鼠IL-10含量感染組顯著高于對照組(P<0.05)，CCL5及GM-CSF含量感染組顯著低于對照組(P<0.05)，其余細胞因子含量無顯著統(tǒng)計學差異(圖1D)；NIH小鼠各細胞因子含量均無顯著統(tǒng)計學差異(圖1E)。

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

注：A：KM小鼠；B：BALB/c小鼠；C：BALB/c-nu小鼠；D：C57小鼠；E：NIH小鼠。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 不同品系小鼠感染組和對照組細胞因子含量比較Note. A, KM mice. B, BALB/c mice. C, BALB/c-nu mice. D, C57 mice. E, NIH mice. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 1 Comparison of cytokine levels between the infection and control groups of different mouse strains

2.3 不同時間點免疫細胞百分比含量變化分析

KM小鼠感染組和對照組總T細胞、CD4+T細胞及總B細胞均在感染第7天即已產(chǎn)生差異(P<0.05)，感染組相較對照組總T細胞和CD4+T細胞含量升高，總B細胞含量降低，后面的三個時間點差異均比較明顯(圖2A)；BALB/c小鼠CD8+T細胞在第感染第7天感染組和對照組均值一致，在第14、21天感染組均值均明顯低于對照組(P<0.05)，第28天兩組均值無統(tǒng)計學差異(圖2B)；C57小鼠CD4+T細胞含量感染組均值在第7天即低于對照組(P<0.05)，直到第28天差異仍明顯?？侭細胞雖然第7天和第14天感染組均值均高于對照組，但差值無統(tǒng)計學意義，第21天和第28天兩組差異顯著(P<0.05)。CD8+T細胞含量在第7，14天均無顯著差異，到第21天感染組均值明顯低于對照組，第28天差異極顯著(P<0.01)(圖2C)；NIH小鼠總T細胞和CD8+T細胞在第7天兩組比較無統(tǒng)計學意義，第14天開始感染組高于對照組(P<0.05)，第21天和第28天維持穩(wěn)定。總B細胞均值第7天兩組比較無統(tǒng)計學差異，第14天及第21天感染組低于對照組(P<0.05)，第28天兩組差異極顯著(P<0.01)(圖2D)。

注：A：KM小鼠；B：BALB/c小鼠；C：C57小鼠；D：NIH小鼠。圖2 不同時間點兩組小鼠免疫細胞均值變化曲線比較Note. A, KM mice. B, BALB/c mice. C, C57 mice. D, NIH mice.Figure 2 Comparison of the changes of mean values of immune cell levels in the two groups of mice at different time points

2.4 不同時間點細胞因子含量變化分析

KM小鼠CXCL10含量在感染第7天兩組無明顯差異，到第14天感染組低于對照組(P<0.05)，后面兩個時間點維持穩(wěn)定(圖3A)；BALB小鼠IFN-γ含量在第7天雖然感染組均值高于對照組，但差異不明顯(P>0.05)，至第14天差異明顯(P<0.05)，第21天感染組均值降低，差異仍明顯(P<0.05)，至第28天兩組差異不顯著(P>0.05)(圖3B)；C57小鼠GM-CSF含量第7天兩組無明顯差異，第14天感染組均值低于對照組，但差異不明顯(P>0.05)，第21天產(chǎn)生明顯差異(P<0.05)，第28天感染組均值進一步降低，差異極顯著(P<0.01)。CCL5含量第7天兩組無明顯差異，第14天開始感染組低于對照組(P<0.05)，第21、28天差異仍明顯。IL-10含量第7天開始感染組高于對照組(P<0.05)，一直到第28天兩組差異仍明顯(圖3C)；BALB/c-nu小鼠TNF-α含量在第7天感染組即高于對照組(P<0.05)，第14、21天差異顯著(P<0.01)，第28天感染組含量降低，兩組差異不明顯(P>0.05)。CCL2含量在第7和14天感染組低于對照組(P<0.05)，至第21天和28天雖然感染組均值低于對照組，但兩者差異不明顯(P>0.05)。IFN-β兩組含量在第7天開始出現(xiàn)差異(P<0.05)，一直持續(xù)到第28天差異仍顯著(圖3D)；CXCL10含量在感染第7天兩組之間無差異，至第14及21天感染組高于對照組(P<0.05)，第28天雖然感染組均值高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。感染組CXCL1含量在第7天即高于對照組(P<0.05)，后續(xù)3個時間點含量維持平穩(wěn)(圖3E)。

3 討論

目前分離的MNV毒株少數(shù)為急性感染株(如MNV-1株)，可在感染動物后幾天被清除，大多為持續(xù)感染株(如MNV-2, MNV-3, MNV-4, CR1,等)，可在動物體內(nèi)長期存在[4-8]。免疫功能健全的小鼠感染MNV無明顯臨床癥狀，但病毒可在動物體內(nèi)長期存在并通過糞便向外排毒，研究發(fā)現(xiàn)MNV感染129小鼠會致其脾中B細胞含量顯著增加，但所用毒株為急性株，同時僅檢測了一個品系的小鼠(129小鼠)[4]，而我國普遍感染的是MNV慢性株，本研究所用毒株分離自國內(nèi)一實驗動物使用場所，屬慢性株[9-10]，所研究品系包括國內(nèi)常用的KM、BALB/c、BALB/c-nu、C57及NIH小鼠，研究MNV感染對不同品系小鼠免疫功能的影響。之所以選擇外周血進行檢測，一是由于脾中的所有淋巴細胞均直接來源于血液，一直與血液進行交換，維持著動態(tài)平衡[11]，外周血中免疫細胞及因子含量變化能較直觀的反應(yīng)動物的免疫狀態(tài)；二是考慮到外周血可多次采集，對動物損傷較輕，可實現(xiàn)對同一批動物的多次檢測，避免不同批動物間的差異；另外采集外周血操作簡便，影響結(jié)果的因素較少。我們參考相關(guān)文獻[12-13]分別于MNV感染前(第0天)及感染后的第7、14、21、28天采集外周血，同時設(shè)立同樣數(shù)量的對照組，對這5個時間點兩組動物的免疫細胞及細胞因子含量進行檢測，一是比較兩組各指標在即感染MNV后4個時間點總體均值的差異，二是繪制每個時間點(包括第0天)的均值變化曲線，分析各指標含量的變化趨勢。

免疫系統(tǒng)通過固有免疫以及特異性免疫發(fā)揮作用，特異性免疫又包括T細胞介導的細胞免疫和B細胞介導的體液免疫。CD3+作為成熟T淋巴細胞表面標志，其數(shù)量可間接反映機體的免疫功能水平[14]，T淋巴細胞進一步分為CD4+和CD8+細胞， CD4+T淋巴細胞可輔助T淋巴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細胞，并促進B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞及活化巨噬細胞，CD8+T淋巴細胞具有殺傷靶細胞的功能，CD4+和CD8+T淋巴細胞含量及CD4+/ CD8+比值平衡是維持機體免疫功能的關(guān)鍵[15]。B淋巴細胞在脾中分化成漿細胞，產(chǎn)生抗體，發(fā)揮體液免疫作用，CD19是B細胞表面的主要標志。NK和NK-T細胞均屬于固有免疫細胞，NK細胞殺傷活性無MHC 限制，不依賴抗體，主要分布于外周血中，NK-T細胞既有T細胞受體，又有NK細胞受體，可通過分泌大量細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，活化后具有NK細胞的細胞殺傷活性。本研究選擇檢測外周血中CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、總B細胞(CD3-CD19+)、NK細胞(CD3-CD49b+)及NK-T細胞(CD3+CD49b+)百分比含量來評價MNV感染對小鼠固有免疫和特異性免疫的影響。細胞因子根據(jù)功能不同可分為干擾素(IFN)、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及趨化因子等。干擾素根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)不同可分為INF-α、INF-β和IFN-γ，分別由白細胞、成纖維細胞和活化T細胞產(chǎn)生，IFN-γ主要由I型輔助性T細胞(Th1)產(chǎn)生，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等特性，多個研究表明，IFN是體內(nèi)外抑制MNV復制所必須的[4,12,16-18]；白細胞介素由淋巴細胞、單核細胞或其他非單個核細胞產(chǎn)生，其中IL-1β在免疫應(yīng)答和組織修復中起作用，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，能刺激集落刺激因子、血小板生長因子等的生成和促使T細胞產(chǎn)生IL-2。II型輔助T細胞(Th2)主要產(chǎn)生IL-6、IL-10，起輔助體液免疫作用[19]，IL-12由抗原提呈細胞和B細胞產(chǎn)生，能誘導IFN-γ產(chǎn)生；腫瘤壞死因子根據(jù)其來源和結(jié)構(gòu)不同，可分為TNF-α和TNF-β兩類，前者由活化的巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生，參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)[20-21]，可促進巨噬細胞和淋巴細胞活化，并對中性粒細胞有較強的活化和趨化作用[22]；根據(jù)集落刺激因子的作用范圍，可將其分為粒細胞CSF(G-CSF)，巨噬細胞CSF(M-CSF)，粒細胞、巨噬細胞CSF(GM-CSF)和多能集落刺激因子。它們可促進不同發(fā)育階段的造血干細胞增殖和分化；趨化因子在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，可分為C、CC、CXC和CX3C等4個亞族，大多屬CC和CXC兩族[23]，前者趨化單核細胞，包括CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、MCP-2及MCP-3等，后者趨化中性粒細胞，包括CXCL1(KC)、CXCL10(IP-10)等。本研究選擇INF-α、INF-β、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、 IL-12、CCL2、CCL5、CXCL1、 CXCL10和GM-CSF等13種細胞因子進行檢測，以期較全面評估MNV感染小鼠后各免疫細胞發(fā)揮作用的情況。

正常小鼠外周血淋巴細胞及細胞因子含量受各種因素的影響，目前還沒有統(tǒng)一的權(quán)威數(shù)據(jù)，本研究對照組小鼠各免疫指標所測得數(shù)據(jù)均與已有報道一致[11,15,19,21]。結(jié)果顯示KM小鼠感染組CD3+T細胞及CD4+T細胞含量均顯著高于對照組(P值均小于0.01)，CD4+/ CD8+比值感染組顯著高于對照組(P=0.048)；B細胞含量則顯著低于對照組(P值小于0.01)，趨化因子CXCL10含量感染組低于對照組(P<0.01)，其他兩組之間沒有統(tǒng)計學差異，說明MNV感染會引起KM小鼠細胞免疫應(yīng)答活躍來發(fā)揮抗病毒作用，B細胞比例降低可能是由于T淋巴細胞含量增加所致。BALB/c小鼠CD8+T細胞感染組低于對照組(P值小于0.05)，CD4+/ CD8+比值及其他細胞差異不明顯，結(jié)合其IFN-γ含量感染組高于對照組(P<0.05)，推測BALB/c小鼠主要通過活化的輔助T細胞來抗MNV感染。與KM小鼠相反，C57小鼠感染組相比對照組CD4+T細胞(P<0.05)和CD8+T細胞(P<0.01)含量均明顯降低，B細胞含量則顯著升高(P<0.05)，同時IL-10含量增加(P<0.05)，IL-10可抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生促炎性活性分子，并抑制T細胞參與細胞免疫應(yīng)答，其高表達與免疫細胞的抑制高度有關(guān)[24]，另外感染組CCL5及GM-CSF含量均顯著低于對照組(P<0.05)，推測MNV的感染可能會增強C57小鼠的體液免疫應(yīng)答，同時會抑制單核細胞的活性，抑制細胞免疫應(yīng)答。NIH小鼠感染組總T細胞及CD8+T細胞含量顯著高于對照組(P值均小于0.01)，CD4+T細胞兩組之間差異無統(tǒng)計學意義，CD4+/ CD8+比值顯著低于對照組(P<0.05)，B細胞含量顯著降低(P<0.01)，而各細胞因子兩組間均無統(tǒng)計學差異，表明NIH小鼠可能主要通過細胞毒性T細胞(Tc)殺傷活性來抗MNV感染。BALB/c-nu小鼠為T細胞免疫缺陷小鼠，其感染組和對照組各免疫細胞含量均無顯著差異，而感染組相比對照組TNF-α、CCL2、 CXCL1、CXCL10含量均顯著升高(P<0.01)，推測BALB/c-nu小鼠主要通過活化巨噬細胞，分泌細胞因子趨化并激活單核細胞及中性粒細胞來發(fā)揮抗MNV效應(yīng)，INF-β含量降低(P<0.05)，可能是MNV持續(xù)感染株抑制IFN-β的釋放所致[25]。各品系小鼠NK及NK-T細胞的含量均無統(tǒng)計學差異，表明NK或NK-T細胞在抗MNV感染中未發(fā)揮明顯作用。上述結(jié)果表明MNV感染對不同品系小鼠免疫指標的影響各不相同，有的指標變化甚至相反，如KM小鼠CD4細胞升高而C57小鼠降低，有的則沒有變化，如BALB/c-nu小鼠各免疫細胞含量兩組間均無顯著差異，有報道MNV感染會加劇Mdr1a-/-小鼠炎癥性腸病模型的疾病進程，而對Smad3缺陷小鼠炎癥性腸病模型則無影響[26]，這可能與MNV對不同小鼠免疫系統(tǒng)影響不同有較大關(guān)系。盡管MNV感染對小鼠免疫指標有明顯影響，所有小鼠從實驗開始到結(jié)束均未觀察到臨床癥狀，體重變化也無差異(數(shù)據(jù)未顯示)，但多個研究發(fā)現(xiàn)MNV感染會導致小鼠肝、脾、肺及腸道等組織病理學病變，肝會出現(xiàn)炎性細胞病灶，脾會發(fā)生紅髓增生，白髓活化，嚴重的壞死或纖維化[26]，這可能與其引起的免疫應(yīng)答有關(guān)。

對總體均值有差異的各指標繪制各時間點的變化曲線，分析發(fā)現(xiàn)不同品系小鼠在感染MNV后各免疫指標隨時間變化的規(guī)律有所不同，KM小鼠在感染第7天兩組均值即產(chǎn)生顯著差異，一直持續(xù)到第28天差異仍顯著，說明KM小鼠免疫系統(tǒng)對MNV感染應(yīng)答較快且更持久。BALB/c及BALB/c-nu小鼠各指標大多在第7天無顯著差異，第14，21天均有顯著差異，至第28天感染組均值恢復正常，兩組差異不顯著，此時動物體內(nèi)仍存在病毒(數(shù)據(jù)未顯示)，表明這兩個品系小鼠對MNV感染的免疫應(yīng)答持續(xù)時間較短，推測MNV更易在這兩個品系形成潛伏感染。C57和NIH小鼠各免疫指標大多在感染MNV第14天才出現(xiàn)顯著差異，直到第28天差異仍顯著，我們沒有進行更長時間的比較，推測兩組均值的差異仍可維持一段時間?？傮w來說，MNV感染對BALB/c及BALB/c-nu小鼠免疫功能影響時間較短，對KM、C57及NIH小鼠影響時間相對較久。

機體的免疫系統(tǒng)非常復雜，要更全面的了解MNV感染對動物免疫功能的影響，還需進一步的研究。由于實驗條件的限制，本研究未進行MNV急性株的比較分析，需要進行后續(xù)實驗研究補充?？傊?，本研究的結(jié)果表明MNV的感染會對常用小鼠的免疫功能造成一定的影響，而且不同品系的動物影響也不同，建議在進行免疫相關(guān)的動物實驗如藥效評價、疫苗評價時選擇MNV陰性小鼠，以避免實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差。