平面細胞極性通路在神經(jīng)管缺陷中的作用

黃少勇，蔡潤澤，陳永昌*

(1.昆明理工大學靈長類轉化醫(yī)學研究院，昆明 650500； 2.云南中科靈長類生物醫(yī)學重點實驗室，昆明 650500)

神經(jīng)管缺陷也被稱作神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)，其發(fā)病率僅次于先天性心臟病，是最常見先天性畸形[1]之一，通常是由于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合不完全或者不閉合造成的。NTDs一旦發(fā)生則不可逆轉，多在孕期流產或出生后很短的時間內死亡[2]。目前，盡管已有神經(jīng)管缺陷的產前診斷方法，但是全球每年有超過30萬的NTDs嬰兒出生，而患有NTDs的嬰兒有較高的死亡率，十分之一患有NTDs的嬰兒會在第一年死亡[3]。神經(jīng)管畸形可分為無腦兒(anencephaly)、腦膨出(encephalocele)、脊柱裂(spina bifida)和顱脊柱裂(craniorachischisis)等幾種類型。NTDs在全世界范圍內的發(fā)病率已經(jīng)達到0.5‰～2‰[4]，并且在不同的地區(qū)發(fā)病率也有著較大的差別。神經(jīng)管閉合依賴于肌球蛋白收縮的細胞運動過程例如根尖收縮，組織和細胞定向重排等過程[5]。NTDs的發(fā)生不僅受遺傳因素影響，也受到環(huán)境因素共同影響，目前常用補充葉酸(folic acid，F(xiàn)A)的方法來預防神經(jīng)管缺陷的發(fā)生，妊娠前和妊娠早期補充適量的葉酸可以降低60%～70%的NTDs的發(fā)生[6]。此外，體外胚胎干細胞分化過程中也發(fā)現(xiàn)葉酸對神經(jīng)分化具有促進作用[7]。因此，在對神經(jīng)管畸形的發(fā)生及其致病機制的研究中，大部分研究的焦點主要集中在葉酸代謝通路及其相關基因，但補充葉酸只能預防NTDs并不能阻止它的發(fā)生且葉酸預防NTDs發(fā)生的具體分子機制尚不清楚[7]。了解研究神經(jīng)管缺陷的致病機制有助于人們對NTDs的治療。近年來科學家通過對小鼠、非洲爪蟾等神經(jīng)管畸形動物模型的研究表明，平面細胞極性(planar cell polarity，PCP)信號通路在神經(jīng)管閉合的過程中起著很重要的作用，PCP信號通路及其相關基因也成為研究神經(jīng)管畸形遺傳基礎的熱點之一。因此，建立合適的動物模型對了解神經(jīng)管缺陷的致病機制，進而更好地研究預防和治療NTDs至關重要。

1 PCP信號通路

神經(jīng)胚的形成是胚胎發(fā)育中的一個基本過程。神經(jīng)胚的發(fā)育影響神經(jīng)管的發(fā)育，而大腦和脊柱的前體是神經(jīng)管[8]。神經(jīng)管是在胚胎發(fā)育過程中由大腦和脊髓的中樞神經(jīng)形成的一個瞬態(tài)結構[7]。神經(jīng)管的閉合是由神經(jīng)板的折疊、升高、結合、在背側中線處融合，從而形成神經(jīng)管[9]。在這一過程中的任何一個步驟發(fā)生中斷就會導致NTDs，例如脊柱裂、無腦兒、無腦畸形和顱脊柱裂[7]。因此在神經(jīng)管閉合的過程中每一步都顯得至關重要，而在整個過程中PCP信號通路有著關鍵作用。PCP信號通路也被稱為非典型Wnt信號通路，它調節(jié)與基底垂直的上皮片的極性[10]。最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)PCP信號通路，其影響果蠅翅膀體毛排列和復眼等高度有序化結構的形成[11]。在哺乳動物中，節(jié)點纖毛的定位以及內耳的纖毛和皮膚上的毛囊中都發(fā)現(xiàn)了PCP信號通路的存在[12]。Adler等人[13]的研究表明，PCP信號通路在進化上非常保守。PCP核心蛋白會形成一個比較復雜的膜復合體，這些蛋白質的數(shù)量和亞細胞分布對胚胎發(fā)育中原腸胚的形成以及神經(jīng)胚形成過程中的PCP信號通路成員的匯聚延伸(convergent extension，CE)發(fā)揮著重要的作用[14]。CE是指在原腸胚形成的后期，神經(jīng)管在后腦與頸部交界的區(qū)域閉合，神經(jīng)管的閉合要求底板細胞群向中線匯聚延伸的一個過程[15]。CE是由非典型Wnt/Frizzled信號通路控制。與典型Wnt信號通路不同的是，非典型Wnt信號通路是通過β-actin穩(wěn)定的控制細胞的命運，即果蠅中PCP通路[16]，而且CE這一過程的發(fā)生是由細胞的極化重排驅動的[17]。因此PCP通路驅動CE讓細胞發(fā)生重新形成神經(jīng)板，SHROOM3、VANGL2和WNT5A基因通過改變細胞形態(tài)使神經(jīng)板折疊直至神經(jīng)管閉合形成。

2 PCP通路的相關基因

PCP通路包括以下6個核心基因：FRIZZLED(FZ)，DISHEVELLED(DSH/DVL)，STRABISMUS/VANGOGH(STAM/VANGL)，F(xiàn)LAMINGO(FMI)/CELSR，PRICKLE(PK)和DIEGO(DGO)等[20]。果蠅FZ基因在多年前就被發(fā)現(xiàn)能調節(jié)平面極性[21]，而且FZ蛋白參與了幾乎所有的Wnt信號通路。但不同的FZ蛋白參與不同的通路，在中樞神經(jīng)中神經(jīng)軸突的生長以及方向定位中就有FZD3蛋白在發(fā)揮著作用[22]。DSH基因是Wnt信號通路的關鍵組成部分，可能也有其他的功能，DSH是Wnt信號的關鍵因素，這些信號來源于Wnt受體家族，即卷曲蛋白。DSH能指揮來自于細胞質膜的信號進入正確的細胞內通路[23]。VANGL基因是PCP通路中第一個確定與人類NTDs有關的基因，并且有VANGL1和VANGL2兩個亞型。非洲爪蟾同源人類VANGL1和VANGL2負性調節(jié)Wnt β-catenin信號通路，編碼Wnt受體β信號通路負調控基因的功能突變會導致腫瘤發(fā)生[24]。FMI基因也是在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，并且與PCP通路相關，F(xiàn)MI基因在果蠅的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著很重要的作用[25]。Chen 等人[26]對184例中國NTDs病人的基因分析，他們發(fā)現(xiàn)3個CELSR基因(CELSR1,CELSR2 和CELSR3)發(fā)揮重要作用，這3個基因的突變會導致NTDs患病的風險大大增加。PK基因在細胞層影響VANGL1的不對稱動力學，因此，PK基因控制自己的定位與VANGL1產生共同的影響[27]。DGO蛋白在脊椎動物上的同源物是DVL，而DVL與Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路都有關[28]，目前在NTDs上研究不多，這些基因都是與PCP信號通路有關。還有一些基因在神經(jīng)管閉合這一過程中也起著比較重要的作用，例如SHROOM3和肌醇代謝中的PIP5K1等基因，Wang等[7]發(fā)現(xiàn)在PIP5KL缺失的小鼠中，神經(jīng)管閉合有缺陷，而且神經(jīng)上皮排列混亂。

3 PCP信號通路與NTDs

已知PCP信號通路核心基因對NTDs的重要性，但除此之外，還有許多基因也對神經(jīng)管的閉合有著很重要的作用，例如：SHROOM3和肌醇代謝中的PIP5K1等基因，Wang等人[7]發(fā)現(xiàn)在PIP5KL缺失的小鼠中，神經(jīng)管閉合有缺陷，而且神經(jīng)上皮排列混亂。下面對SHROOM3，VANGL2和WNT5A這三個基因是如何影響PCP信號通路，進而導致NTDs的發(fā)生進行闡述。

Jeffrey等[29]對小鼠的SHROOM3基因研究發(fā)現(xiàn)，SHROOM3基因的嚴重突變會導致嚴重的大腦畸形。因此，SHROOM3基因可能對神經(jīng)管閉合過程中是一個關鍵的因素。在大多數(shù)脊椎動物中它SHROOM3基因的正常表達是神經(jīng)管形成的必要因素，該基因在進化上是保守的。在該研究中，SHROOM3基因的功能的喪失會導致小鼠發(fā)生無腦畸形、腦膨出、脊柱裂等畸形，說明神經(jīng)管閉合失敗。其原因是SHROOM3的功能喪失會使神經(jīng)折疊結構向外部擴展而不能在背側中線處匯合成。SHROOM3編碼一個PDZ結構域的蛋白質，并且從多層次來調節(jié)細胞結構。首先，內源性SHROOM3蛋白黏附于細胞骨架上；第二，局部表達的SHROOM3蛋白改變纖維肌動蛋白的分布，并且該蛋白質可以與纖維肌動蛋白結合；第三，SHROOM3蛋白直接結合肌動蛋白；最后，神經(jīng)上皮的細胞骨架會影響突變體的胚胎[30]。SHROOM3基因的缺失會阻斷神經(jīng)胚的形成，導致神經(jīng)管閉合失敗，由此引發(fā)的神經(jīng)管閉合缺陷并不能通過葉酸補充來預防，反而大劑量的補充會增高死亡率。目前，SHROOM3基因在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮功能的機制尚不清楚。除了SHROOM3基因之外，Chen和他的團隊[31]對NTDs的病人研究發(fā)現(xiàn)，SHROOM2基因的突變會破壞PCP信號通路，進而改變細胞骨架后重塑導致NTDs風險增加。

VANGL2基因是1988年Taylo[32]在從果蠅的基因組發(fā)現(xiàn)的，根據(jù)表型不同，最先發(fā)現(xiàn)的基因而被命名為STBM或VANGL2。隨著研究的深入，Kibar和他的同事[33]推測人類的NTDs由VANGL1及VANGL2基因突變引起的，這兩個基因在小鼠中與平面細胞極性有關。在NTDs患者中發(fā)現(xiàn)了很多種VANGL2基因突變，證實了NTDs的發(fā)生與VANGL2基因有密切的關系[34]。在脊椎動物的早期胚胎發(fā)育過程中，CE驅動胚胎軸和神經(jīng)板的收縮和延長。在幾種模式生物的原腸胚中，VANGL2在CE過程中起著決定性的作用[35]。Park等人[36]發(fā)現(xiàn)在爪蟾胚胎中過表達VANGL2能夠抑制CE的發(fā)生。如果在這一過程中VANGL2基因發(fā)生嚴重突變，可能導致高度組織特異性的上皮結構失去正常的極性，從而導致不同程度的神經(jīng)管缺陷的發(fā)生。Gabriel L Galea和他的團隊[37]在VANGL2突變的純合小鼠中發(fā)現(xiàn)，VANGL2的突變阻止了小鼠神經(jīng)管的正常閉合，導致了NTDs的發(fā)生。因此，闡明VANGL2基因在神經(jīng)管閉合的過程中的分子作用機制，才能有效的預防或者阻止NTDs的發(fā)生。

1999年，Yamaguchi等[38]發(fā)現(xiàn)WNT5A基因的缺失會導致胚胎在發(fā)育過程出現(xiàn)差錯從而導致新生兒的死亡。Shimizu[39]發(fā)現(xiàn)，在果蠅中WNT基因作用于PCP信號通路的上游。Wnt信號通路非常保守，且與神經(jīng)管畸形密切相關。Kimura-Yoshida等[7]發(fā)現(xiàn)Wnt信號調制器DKK1和KREMEN1定位在神經(jīng)板邊界。Kilian等人[40]發(fā)現(xiàn)WNT5A是后內胚層如脊索中CE過程所需要的。Mcgreevy等[41]發(fā)現(xiàn)WNT5A是PCP通路中的一個配體，在WNT5A敲除的小鼠中呈現(xiàn)特有的CE過程，WNT5A和SHROOM3在遺傳上是相互作用的。2017年對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，PCP通路的一些組分會調節(jié)WNT5A，使皮質脊髓軸突成長成圓錐細胞[5]。

4 NTDs動物模型

NTDs的致病原因相當復雜，與單基因控制的疾病不同，遺傳因素和環(huán)境因素共同作用于NTDs。在遺傳因素中，雖然發(fā)現(xiàn)了許多基因與神經(jīng)管閉合有關，但是這些基因具體如何發(fā)揮作用導致NTDs尚不清楚。建立合適的動物模型是探究相關基因及信號通路、營養(yǎng)因素等與NTDs相關性的重要手段。

表1 主要NTDs動物模型及相關基因

有關NTDs代表性動物研究模型構建見表1。從表中我們可以得出目前大部分研究NTDs的動物模型都集中在小鼠、非洲爪蟾和斑馬魚等低等模式動物。因為NTDs的發(fā)生是在神經(jīng)發(fā)育早期發(fā)生的，用其他的模式動物很難觀察到神經(jīng)管閉合的過程。而上述三種動物模型則可以很清楚和直觀的觀察到神經(jīng)管閉合過程中的變化，并且敲除這些動物的與NTDs相關的基因很容易實現(xiàn)，因此很多科學家用這些動物來研究NTDs。在這些研究模型中，很多研究的基因是PCP信號通路中的主要基因，也有其它一些重要基因如SHROOM3，TRPM6，和PAX3等基因。在表中的這些基因都與神經(jīng)管閉合的過程中的PCP信號通路以及CE過程有著很重要的關系。由于基因編輯技術的發(fā)展，這些動物模型的建立更加容易，但是也存在一些局限性。小鼠、非洲爪蟾和斑馬魚的大腦發(fā)育有著很大的差別，一些基因表達的時間和空間也不盡相同。對于人類NTDs來說，這些模式動物的大腦發(fā)育和人類大腦發(fā)育有著天壤之別。在這些模式動物中，某些與NTDs相關基因的突變可以導致它們發(fā)生神經(jīng)管閉合不全，但是這些結果不一定在人類上可以發(fā)生。由于非人靈長類動物的大腦和人發(fā)育的相似度很高，所以研究人類疾病的動物模型非人靈長類動物是最好的選擇。但是由于嵌合體的問題，在非人靈長類動物上產生人類NTDs有著很大的難題。因此，研究與人類大腦發(fā)育及其相似的非人靈長類動物模型迫在眉睫。

5 問題與展望

本文通過SHROOM3，VANGL2和WNT5A三個基因來闡明PCP信號通路在神經(jīng)管缺陷中的一些作用和和分子機制。在正常的發(fā)育過程中，細胞表達SHROOM3蛋白，產生的蛋白使細胞呈楔型，并且變長，引起神經(jīng)板卷曲。還有一些細胞如附近的皮膚和表皮細胞等，則推動和形成折疊，從而促使神經(jīng)管的閉合。VANGL2基因參與了CE這個過程，而CE又是PCP信號通路的一個重要組成部分，因此VANGL2基因的突變也會導致神經(jīng)管的閉合不全。而WNT5A基因作用與PCP信號通路的上游來參與神經(jīng)管閉合這一過程，但是WNT5A基因突變不一定會導致神經(jīng)管缺陷的發(fā)生。

目前世界各國采用給育齡婦女補充FA來預防NTDs的發(fā)生，雖然達到了一定的預防效果，但還是不能阻止NTDs的發(fā)生。問題在于NTDs的致病原因復雜，而且與之相關的基因較多。補充葉酸可以預防由VANGL2基因突變導致的NTDs，但是還有很多基因的突變導致的NTDs是葉酸所不能預防的。近年來，很多科學家都投入到研究NTDs的工作中，雖然取得了很大的成功，但是離治療還有很大一段路要去探索。目前研究的NTDs的動物模型只有小鼠，大鼠和斑馬魚等模式生物，這些動物模型只能幫助了解和探索NTDs的發(fā)病機制和作用機理。但是，這些動物模型與人類的發(fā)育有著很大的差別，因此建立非人靈長類NTDs模型至關重要，而且一個成功的NTDs非人靈長類動物模型對發(fā)現(xiàn)新的治療方法和預防NTDs的發(fā)生有著十分重要的意義。