兔腦出血模型研究進(jìn)展

齊俊芳，包 龍

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

腦出血是指由腦血管破裂引起的腦實(shí)質(zhì)出血。我國(guó)腦出血占所有腦卒中的18.8%～47.6%。腦出血發(fā)病率危險(xiǎn)，病情變化迅速，死亡率高。3個(gè)月內(nèi)的死亡率20%～30%[1]。腦出血造成了沉重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故對(duì)腦出血的病因、病理生理改變、診斷、治療等方面的研究近年來重視程度逐漸加深。為了更好的認(rèn)識(shí)和了解腦出血，需借助于與臨床作用機(jī)制相似的模型，并通過它來研究其病理生理機(jī)制、診斷、治療等。因此，制作穩(wěn)定且可復(fù)制的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ陀葹橹匾?。腦出血的動(dòng)物模型始建立于20世紀(jì)60年代，通過輸注自體血建立腦出血模型，主要應(yīng)用于狗、猴子、貓等大型動(dòng)物[2]。隨后由于立體定位儀的發(fā)明、動(dòng)物倫理、費(fèi)用等原因，加之大鼠尾狀核較易定位，更多的重心放在大鼠腦出血模型的一系列研究上，因此腦出血的大鼠模型較為成熟。而兔腦出血模型始于20世紀(jì)80年代[2]，與大型動(dòng)物模型相比費(fèi)用較少，且其高成功率和低長(zhǎng)期死亡率可以幫助醫(yī)療人員更好研究腦出血后的長(zhǎng)期神經(jīng)功能和病理生理機(jī)制；與大鼠相比，兔基底神經(jīng)節(jié)更發(fā)達(dá)，兔腦容積明顯大于大鼠，便于外科手術(shù)和標(biāo)本采集。因此，是較為理想的制作腦出血模型的動(dòng)物。

1 兔腦出血模型的建立方法

1.1 自體血注入腦出血模型

該模型的建立主要分為采血過程和血液注入過程。

取血過程：根據(jù)自體血的來源，一般有以下幾種：耳正中動(dòng)脈血，股動(dòng)脈血[3-4]，心室血[5-6]。心室穿刺血液采樣血液采集時(shí)間短，不易凝固。然而穿刺過程有導(dǎo)致心跳驟停的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用率不高。股動(dòng)脈血液采集創(chuàng)傷性大，采血成功率低，影響下肢功能，干擾行為觀察評(píng)分[2]，需抽取少量血液時(shí)一般不作為首選。耳正中動(dòng)脈采集血較為簡(jiǎn)便，損傷較前兩者都小，不影響動(dòng)物的行為學(xué)評(píng)分，但取血時(shí)間稍長(zhǎng)且易凝血，需采血成功后盡快注入腦內(nèi)，此為建造兔腦出血模型中最為常用的采血方法。在兔腦出血實(shí)驗(yàn)中為了更好模擬臨床腦出血，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈血不抗凝，直接將新鮮動(dòng)脈血注入腦內(nèi)。

注血過程：獲得自體血后，如何注入腦內(nèi)又是個(gè)很關(guān)鍵的問題。自體血注入腦出血模型目前主要有兩種方法：一種是抽取新鮮的自體動(dòng)脈血，然后直接注射到大腦中，另一種是動(dòng)脈插管顱內(nèi)注射。注射目標(biāo)區(qū)域多選擇基底節(jié)區(qū)(人腦出血好發(fā)部位)，另外可根據(jù)不同的研究目的、實(shí)驗(yàn)要求選擇不同的注入部位，如基底節(jié)區(qū)、腦葉等均可。目前，多采用立體定位儀與兔腦圖譜結(jié)合使用以進(jìn)行定位。固定兔頭后，沿正中線作切開口，暴露“十”字縫和“人”字縫。調(diào)整兔頭部平面，使“十”字縫比“人”字縫高1.5 mm。參考Sawyer兔腦立體定位圖譜[7]，根據(jù)目標(biāo)區(qū)域找到對(duì)應(yīng)坐標(biāo)。該圖譜將穿過前囟中心(十字縫中心)的冠狀面，作為冠狀零平面(AP0)。A1表示AP0前1 mm的冠狀面，P1表示AP0后1 mm的冠狀面。將通過十字縫交叉點(diǎn)的矢狀平面作為矢狀零平面，如 R6代表矢狀零平面右6 mm的矢狀平面，水平零面 H0在顱骨頂前囟下方12 mm處的水平面。制作兔腦出血模型時(shí)常用的位置有：內(nèi)囊后肢(P1 mm, R6 mm, H13 mm)[8]，基底節(jié)外側(cè)區(qū)(A2 mm, R5 mm, H6 mm)[4]等。注血量多為動(dòng)物腦體積的1%～5%，兔為0.5～3 mL[9]。1985年Kaufman等[10]首次將兔用于顱內(nèi)出血(intracerebral hemorrhage，ICH)模型研究，用0.5 mL、0.75 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL等不同注血量將一組兔腦出血的形態(tài)學(xué)和生存率進(jìn)行了比較。其中注射2～3 mL血液的兔死亡率為41%，且分組中注射2 mL，2.5 mL，3 mL自體血的兔隨著注入血液的增多，兔的死亡率逐漸增高，分別為1/9，4/6，2/2，這些兔的死亡在注血后幾小時(shí)內(nèi)即可迅速發(fā)生。故若需要長(zhǎng)期觀察兔模型，為保證兔的長(zhǎng)期生存率，在兔腦出血的建造中要控制注血量，該實(shí)驗(yàn)提示控制在1.5 mL以下相對(duì)較為安全。另外在該實(shí)驗(yàn)中也觀察到小劑量注血后血液易進(jìn)入腦室或蛛網(wǎng)膜下腔的情況，超過2 mL時(shí)可觀察到明顯的血液溢出，故在制作兔腦出血模型時(shí)需考慮到注射壓力高導(dǎo)致破入腦室或沿針道返流的問題，注血量，注射速度，留針時(shí)間都是關(guān)鍵。而近幾年有學(xué)者分梯度定量向兔腦內(nèi)注血，結(jié)果示0.3 mL是最佳注入量[4]，而另外也有學(xué)者注入0.5 mL血液兔也耐受良好[11-13]。從近些年文獻(xiàn)來看，注血量無統(tǒng)一定論，綜合來看注血量均不超過0.5 mL、注射速度不超過40 μL/min。

一種是將新鮮的自體動(dòng)脈血直接注入大腦。具體如下：2001年張亦波等[4]采用雙套管結(jié)合微量泵和立體定位術(shù)進(jìn)行兩次注血、三次拔針法成功造出了兔腦基底神經(jīng)節(jié)出血模型。雙套管包括內(nèi)套管和外套管以及針芯。第一步：以40 μL/min向套管內(nèi)注入目標(biāo)注血量的血1/4，然后將針芯插入內(nèi)套管，停針7 min；第二步：將內(nèi)插管向下插入2.5 mm(通過血凝塊)并從股動(dòng)脈抽取0.3～0.5 mL新鮮血液。使用顯微注射泵以40 μL/min將剩余的3/4血液注入套管，再將針芯插入套管內(nèi)。拔針分三步：第一步：插入芯后，將套管固定8 min后，將內(nèi)套拉出2.5 mm；第二步：在該位置固定套管10 min后，將兩個(gè)套管同時(shí)拔出3 mm；第三步：該位置固定12 min后，將兩個(gè)套管同時(shí)緩慢拔出。本實(shí)驗(yàn)形成的34例腦內(nèi)血腫均為100%，針道血液返流率為0。作者將新鮮的未肝素化自體血注入34只兔基底神經(jīng)節(jié)的側(cè)面區(qū)域，并通過連續(xù)冰凍切片計(jì)算血腫體積、觀察血腫本身和周圍組織形態(tài)。結(jié)果300 μL組中的20只兔只有2例失敗，合格率達(dá)90%，且失敗的兔考慮與針的定位和麻醉的不穩(wěn)定性有關(guān)。500 μL組8只兔的合格率僅為62.5%，3例不合格。因此，筆者認(rèn)為注射量300 μL所形成的出血量適中，可觀察到兔有腦出血后的癥狀表現(xiàn)，較少出現(xiàn)短期內(nèi)迅速死亡的事件，故是適當(dāng)?shù)难鹤⑸淞?。該?shí)驗(yàn)中的方法避免了兔注血期間的血液反流，和在拔出針頭時(shí)和取出針頭后，由針頭路徑中的血液損失引起的血腫量的差異。而2009年Yu等[3]采用了類似的方法建造兔腦出血模型。據(jù)報(bào)道該方法的實(shí)驗(yàn)存活率達(dá)到了93.5%，且未發(fā)生破入側(cè)腦室和蛛網(wǎng)膜下腔的意外，該方法使自體血注射法形成腦內(nèi)血腫模型達(dá)到穩(wěn)定可控。另外在制作腦出血模型時(shí)，考慮到兔的凝血時(shí)間約為5 min[14]，留針時(shí)間一般都不小于5 min[3-4, 6, 12, 15-16]。

另一種是通過動(dòng)脈插管進(jìn)行顱內(nèi)血液注射。2001年Qureshi等[17]為了研究與腦出血相關(guān)的細(xì)胞損傷，遂利用此法建造兔腦出血模型，通過自制的分流導(dǎo)管將動(dòng)脈血立體定位植入兔的額葉，并使用兔的動(dòng)脈壓將血液緩慢注入額葉的深部。該實(shí)驗(yàn)指出緩慢的灌注會(huì)限制血液破入蛛網(wǎng)膜下腔或腦室，且可以模擬漸進(jìn)的腦出血血凝塊形成過程，更接近人類腦出血的自然過程。

自體血注入腦出血模型不能模擬腦出血時(shí)動(dòng)脈破裂和快速血腫形成的過程，也不能模擬出血后血腫的持續(xù)擴(kuò)張。然而，由于注射的為非肝素化的自體血，故可以觀察到血液凝固過程中血管活性釋放物質(zhì)對(duì)腦循環(huán)和腦組織的影響。因此，它更接近臨床腦出血，并且在一定程度上類似于人腦出血的病理過程，加之操作簡(jiǎn)單且易于定位，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇目標(biāo)區(qū)域致大腦各個(gè)部位出血，故在家兔腦出血模型制作時(shí)是最常用的方法。

1.2 膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型

膠原酶是一種金屬酶，可以破壞細(xì)胞基底膜和組織中細(xì)胞間基質(zhì)的膠原蛋白，導(dǎo)致血管壁受損并導(dǎo)致血液外滲。膠原酶有很多種，其中IV型和VII型細(xì)菌膠原酶廣泛用于腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷闹苽?，目前還沒有研究報(bào)道它們之間的差異[18]。1993年，Rosenberg等[19]首次報(bào)道了膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型。該模型的缺點(diǎn)是膠原酶誘導(dǎo)的腦出血形成時(shí)間較長(zhǎng)，且血腫為彌漫性滲血與腦組織的混合物。它并非完全的血腫，故與臨床腦內(nèi)血腫的急性發(fā)生存在一定差距。為此，一些學(xué)者通過向大腦注射膠原酶和肝素混合物來改善這一點(diǎn)。據(jù)研究該模型注射后比較單純膠原酶注射血腫區(qū)形成，血腫大小基本一致，神經(jīng)行為學(xué)顯示偏癱提前。這種改進(jìn)的優(yōu)點(diǎn)是可以顯著減少產(chǎn)生相同大小的血腫所需的膠原酶的量。另外研究中觀察到加入肝素后致出血時(shí)間延長(zhǎng)，血腫迅速形成，形狀一致，可重復(fù)性高。

該方法主要應(yīng)用于大鼠。有國(guó)內(nèi)學(xué)者曾報(bào)道將該方法應(yīng)用于兔，成功造出了兔腦出血模型，據(jù)報(bào)道，兔內(nèi)囊出血可在注入膠原酶30 min內(nèi)引起，效果穩(wěn)定[20]。該學(xué)者采用微量注射器抽取膠原酶配置液6 μL，其配置比例為(VII型膠原酶0.2 U+肝素2 U)/μL，需要在5 min內(nèi)緩慢注入兔腦組織，停針2 min后慢慢取出針頭。注射膠原酶30 min后，固定腦并取出冠狀切片，可觀察到明顯的腦出血。組織切片顯示大量紅細(xì)胞從血管中漏出。行為學(xué)方面觀察到兔在注射膠原酶4 h后具有肢體運(yùn)動(dòng)障礙，身體扭曲到一側(cè)，詳細(xì)的觀察顯示兔的舌頭是歪斜的，舌頭會(huì)伸到病變肢體的對(duì)側(cè)[20]。

膠原酶注入法誘導(dǎo)腦出血，操作簡(jiǎn)單，出血量容易控制，周期短。其優(yōu)點(diǎn)是可以更好地模擬人類自發(fā)性顱內(nèi)出血和出血后血腫不斷擴(kuò)大的動(dòng)態(tài)過程，該模型的成功率和穩(wěn)定性較高，但該模型的缺點(diǎn)是膠原酶誘導(dǎo)的腦出血主要是滲出，而不是完全血腫。臨床上見到的腦血管破裂引起的腦出血與之有一定的差距，且炎癥反應(yīng)明顯，不適合研究腦出血后炎癥反應(yīng)的機(jī)制[21]。與自體血注入腦出血模型相比，該方法對(duì)腦組織具有直接的細(xì)胞毒作用。該方法使血腦屏障受損更嚴(yán)重，神經(jīng)功能缺損程度也更重，恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)。因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中多用此來研究腦出血后的水腫情況或藥物治療后的預(yù)后觀察。

1.3 創(chuàng)傷致腦出血模型

通過外部打擊暴力的方法造成兔的顱腦外傷，從而導(dǎo)致顱內(nèi)血腫形成。該方法所受暴力不可量化加之個(gè)體差異影響，導(dǎo)致顱內(nèi)血腫形成時(shí)機(jī)、大小、部位無法預(yù)測(cè)，且動(dòng)物易多發(fā)傷、心跳驟停，需心肺復(fù)蘇、開通靜脈通道及時(shí)搶救等，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求高耗費(fèi)大且造模成功率不穩(wěn)定[22-24]，造模成功率低且可重復(fù)性差[25]，導(dǎo)致在兔腦出血?jiǎng)游锬Ｐ徒ㄔ熘惺芟蕖?/p>

1.4 兔腦出血模型的其他方法

通過刺破大腦中動(dòng)脈制作腦出血模型是近年來隨著影像技術(shù)的進(jìn)步新興的一種方法。據(jù)報(bào)道，2005年，周宇騰等人[26]實(shí)施了數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography, DSA)介導(dǎo)下的犬大腦中動(dòng)脈穿刺術(shù)，成功制作了腦出血模型。該方法可以在很大程度上模擬人腦出血中血管破裂的過程，但該方法成本高，操作者需要高技術(shù)并且易受輻射的影響?；谳椛浒踩蛩乜紤]，2012年周璇等[27]首次應(yīng)用超聲介入方法制作腦出血模型，大腦中動(dòng)脈的主要分支在超聲引導(dǎo)下被針刺引起出血，類似于人 ICH中的血管破裂。然而，限于聲學(xué)特性，超聲引導(dǎo)的ICH模型需要開放骨窗，其對(duì)動(dòng)物具有很大的損害并且出血量不固定。該方法與缺血誘發(fā)腦出血[28]、腦血管撕脫誘導(dǎo)腦出血模型[29]主要見于應(yīng)用于大型動(dòng)物如犬類、豬類等，在小動(dòng)物腦出血模型上應(yīng)用較為罕見。偶有學(xué)者曾在白兔上利用顯微鏡下用特制刀片鉤破大腦中動(dòng)脈制作腦出血模型，實(shí)驗(yàn)中共使用50只兔制作腦出血模型，實(shí)驗(yàn)前期4 d共死亡8只兔，前期死亡率偏高導(dǎo)致長(zhǎng)期存活率受限[30]。

2 兔腦出血模型的評(píng)估方法

兔腦出血模型建立后，成功與否可從多方面評(píng)估，如：行為學(xué)評(píng)分、大體解剖、影像學(xué)(多為頭顱CT或MRI)、病理學(xué)等。行為學(xué)方面：目前無針對(duì)兔腦出血的行為學(xué)評(píng)分，兔腦出血的實(shí)驗(yàn)中多采用犬腦卒中、鼠腦卒中的評(píng)分，目前兔腦出血實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的為Purdy評(píng)分法(犬)[31]、Longa法(鼠)[32]；大體解剖方面：一般為處死兔后斷頭取腦、切片，進(jìn)針層面多可見血腫形成表示造模成功，切片可放置于計(jì)算掃描儀下計(jì)算血腫面積(S)，進(jìn)而累加計(jì)算血腫體積，公式為血腫體積(μL)=(S1+S2+S3+…+Sn)×總掃描片數(shù)×0.5/2[4]；影像學(xué)方面：CT、MRI在兔腦出血造模評(píng)價(jià)中較常應(yīng)用[33]，影像學(xué)中可見到異常出血灶密度影存在，若與進(jìn)針部位相符，即可證明血腫存在，優(yōu)點(diǎn)是無創(chuàng)、快速、便捷，并可通過影像測(cè)量計(jì)算血腫體積，多采用Tada公式(出血量=長(zhǎng)×寬×高×0.5)[12]；病理方面：評(píng)價(jià)腦出血造模成功與否的金標(biāo)準(zhǔn)，兔斷頭取腦，腦組織置于福爾馬林中固定、石蠟包埋、切片、HE染色，切片可見出血灶內(nèi)大量變形紅細(xì)胞，邊緣可見炎性細(xì)胞，周邊可見壞死神經(jīng)細(xì)胞和及膠質(zhì)細(xì)胞，即可通過病理證明兔腦出血造模成功。

3 小結(jié)

相比于兔腦出血模型，大鼠腦出血模型更為成熟及在實(shí)驗(yàn)中使用數(shù)量、分組存在一定的優(yōu)勢(shì)，但從手術(shù)操作、標(biāo)本收集、影像學(xué)評(píng)價(jià)、長(zhǎng)期預(yù)后觀察等方面來看，大鼠腦出血模型有局限性，而兔有更大的優(yōu)勢(shì)，原因如下：①相比大鼠，兔腦生理解剖更接近人腦，人腦腦出血多發(fā)生于基底節(jié)區(qū)，而兔腦基底節(jié)區(qū)較為發(fā)達(dá)，制作基底節(jié)區(qū)腦出血模型較為方便。②兔腦平均腦容量為30 g，大鼠平均為6 g，相差五倍[34]，大鼠腦容積小，造模成功后腦血腫測(cè)量及影像學(xué)評(píng)價(jià)較為困難；而兔腦大小適中，便于磁場(chǎng)處理和CT掃描[30]，腦出血后影像的變化、腦出血后周圍腦組織的灌注、測(cè)量腦血腫范圍的實(shí)驗(yàn)中較常用到兔模型。③兔腦容積大，手術(shù)操作、標(biāo)本收集較為方便，實(shí)驗(yàn)中比較腦血腫清除術(shù)的效果時(shí)常用到兔模型，加之兔靜脈表淺，便于采血、監(jiān)測(cè)血清指標(biāo)及開通靜脈通道維持術(shù)中生命體征、便于搶救[4]。④兔性情溫和，腦出血多為一側(cè)肢體癱瘓，一般無其他損害，易于長(zhǎng)期飼養(yǎng)、觀察[30]，可為大型動(dòng)物(如狗、猴)腦出血建模提供參考依據(jù)。

本文中提到的刺破大腦中動(dòng)脈制作腦出血模型、創(chuàng)傷腦出血模型由于各自的局限性，目前較少用于兔腦出血實(shí)驗(yàn)研究?？傮w來說，自體血注入腦出血模型和膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型是兔腦出血實(shí)驗(yàn)中兩種較為常見的建模方法。如果觀察腦出血的早期形成和病理生理變化，則自體血注入法更為合適，如果觀察長(zhǎng)時(shí)間過程的功能預(yù)后，則應(yīng)選擇膠原酶誘導(dǎo)模型。在兔腦出血模型的構(gòu)建中，前者更為經(jīng)典和成熟，膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型在大鼠腦出血模型的構(gòu)建中應(yīng)用相對(duì)較為成熟，而在兔腦出血模型建造中應(yīng)用相對(duì)較少，故膠原酶在兔腦出血模型中的應(yīng)用劑量、注射速度、注射時(shí)間、留針時(shí)間尚無統(tǒng)一定論，可進(jìn)一步研究探索。