Uox基因敲除自發(fā)高尿酸血癥對小鼠體重、血壓及血液生理生化的影響

潘明子，賀玉偉,，李海龍，梁 楠，李長貴,*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266021；2.青島大學(xué)代謝病研究院，山東 青島 266021)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是由尿酸合成增加和(或)排泄減少引起的代謝性疾病，其定義為在正常嘌呤飲食狀態(tài)下，非同日兩次空腹血尿酸水平男性高于420 μmol/L，女性高于360 μmol/L[1]。近年來，隨著生活水平的提高和高嘌呤食物攝入的增加，HUA的患病率逐年上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。大量研究證實，HUA與肥胖、高血壓、慢性腎臟病、2型糖尿病、痛風(fēng)等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，嚴重危害人類健康[3-7]。隨著對HUA研究的深入，構(gòu)建合適的高尿酸血癥動物模型成為揭示其發(fā)病機制與研發(fā)治療藥物亟需解決的問題。課題組前期使用類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶敲除目的小鼠的尿酸氧化酶(urate oxidase，Uox)基因，基于C57BL/6 J遺傳背景成功構(gòu)建了Uox敲除(Uox-/-)小鼠模型。該模型血尿酸水平長期>420 μmol/L，自發(fā)高尿酸血癥，在62周內(nèi)存活率約為 40%，同時伴隨腎功能損害、脂質(zhì)代謝障礙、胰島素分泌受損等代謝紊亂的特征[8]，類似于人類高尿酸血癥患者，為HUA發(fā)病機制研究及新藥研發(fā)提供了較為理想的動物模型。

為明確Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥對C57BL/6 J小鼠體重、血壓及血液生理生化指標的影響，本研究對三種不同尿酸酶基因的小鼠上述指標進行檢測和分析，為利用該小鼠進行生命科學(xué)研究和生物醫(yī)藥研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

取同窩出生的6、12周齡C57BL/6 J尿酸氧化酶基因敲除(Uox-/-)、尿酸氧化酶基因雜合缺失(Uox+/-)及野生型(Uox+/+)對照小鼠，每組12只，雌雄各半。野生型C57BL/6J小鼠購自上海南方模式生物科技股份有限公司[SCXK(滬)2014-0002]。Uox-/-小鼠由作者所在實驗室構(gòu)建[8]，具體方法如下：選擇Uox兩端DNA序列，體外轉(zhuǎn)錄，得到兩段mRNA序列，分別標記為TALEN-L1 mRNA和TALEN-R1 mRNA。該序列可將尿酸氧化酶基因原序列中的T替換為U，產(chǎn)生終止密碼子，使尿酸氧化酶基因變?yōu)閱』虿槐磉_。將這兩個序列注射到C57BL/6 J小鼠的受精卵胞質(zhì)中，得到F0代嵌合體小鼠；F0代小鼠與野生型小鼠進行雜交，獲得F1代雜合體小鼠；雜合體小鼠自交后獲得尿酸氧化酶基因敲除的純合體小鼠，即為自發(fā)高尿酸血癥小鼠模型。所有小鼠均按照SPF級標準飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物中心[SYXK (魯)2015-0003]IVC無菌通風(fēng)籠中，自由飲水、攝食，12 h晝夜循環(huán)，室溫(22±2)℃，濕度(75±5)%。實驗過程中，在不影響實驗要求和實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，嚴格按實驗動物使用的3R原則關(guān)注實驗動物福利。

1.2 主要試劑與儀器

美國肯特CODA Monitor多動物多通道尾袖套法無創(chuàng)血壓系統(tǒng)，羅氏Roche cobas 6000 c501全自動生化分析儀和配套試劑，邁瑞B(yǎng)C-5300全自動血細胞分析儀和配套試劑，凱豐KFS1000電子秤，Thermo Heraeus Fresco 17微量冷凍離心機，離心管，EDTA.K2抗凝管。

1.3 實驗方法

小鼠生長至6周齡和12周齡，檢測小鼠體重、血壓及血液生理生化指標。

1.3.1 體重的測量

禁食12 h，用電子秤分別稱取小鼠體重。

1.3.2 血壓的測量

使用美國肯特CODA Monitor多動物多通道尾袖套法無創(chuàng)血壓系統(tǒng)對小鼠血壓進行監(jiān)測，每只小鼠測量三次以上，取平均值作為最終血壓。

1.3.3 血液生理指標的檢測

從小鼠眼眶后靜脈叢采集0.1 mL小鼠靜脈血至EDTA.K2抗凝管內(nèi)，快速彈勻，進行血生理指標測定。12項血生理指標分別為：紅細胞壓積(HCT)、血紅蛋白(HGB)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細胞體積(MCV)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)、血小板體積分布寬度(PDW)、血小板(PLT)、紅細胞計數(shù)(RBC)、紅細胞體積分布寬度(RDW-C)、紅細胞體積分布寬度(RDW-S)和白細胞計數(shù)(WBC)。

1.3.4 血液生化指標的檢測

從小鼠眼眶后靜脈叢采集0.3 mL小鼠靜脈血至離心管內(nèi)，4℃靜置20 min，3000 r/min離心10 min，取上層血清進行血生化指標測定。15項血生化指標分別為：白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST/ALT)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IDBIL)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和尿酸(UA)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥對小鼠體重的影響

結(jié)果顯示，6周齡雌性Uox-/-小鼠和12周齡Uox-/-小鼠體重均顯著低于Uox+/+對照小鼠(P<0.05)。相較于雄性Uox+/+和Uox+/-小鼠體重顯著高于同周齡雌性小鼠(P<0.05)，雄性和雌性Uox-/-小鼠之間體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。三種基因背景12周齡小鼠體重均明顯高于6周齡小鼠體重(P<0.01)。見表1、圖1。

2.2 Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥對小鼠血壓的影響

結(jié)果顯示，6周齡雌性Uox-/-小鼠和12周齡雄性Uox-/-小鼠血壓顯著高于Uox+/+對照小鼠(P<0.05)。Uox-/-小鼠不同性別及不同周齡間血壓比較沒有差異。見表2、圖2。

2.3 Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥對小鼠血液生理指標的影響

結(jié)果如表3所示，Uox-/-小鼠HCT、HGB、MCH、MCV、RBC和RDW-S均顯著低于Uox+/+對照小鼠(P<0.05)，而MCHC和PCT高于Uox+/+對照小鼠(P<0.05)。6周齡Uox+/-小鼠HCT、HGB和RBC也明顯低于Uox+/+對照小鼠，PCT高于Uox+/+對照小鼠(P<0.05)。與6周齡Uox-/-小鼠相比，12周齡Uox-/-小鼠MPV和PDW明顯升高(P<0.05)，WBC顯著降低(P<0.01)。

表1 三種小鼠體重測量結(jié)果

注：與同周齡同基因型雌性小鼠相比，aP<0.05，AP<0.01；與同性別同基因型6周齡小鼠相比，bP<0.05，BP<0.01；與同周齡同性別Uox+/+小鼠相比，cP<0.05，CP<0.01。下表同。

Note.Compared with the female mice of the same age and the same genotype,aP<0.05,AP<0.01.Compared with the 6-week-old mice of the same sex and the same genotype,bP<0.05,BP<0.01.Compared with theUox+/+mice of the same age and the same sex,cP<0.05,CP<0.01.The same in the following tables.

注：與同周齡同基因型雌性小鼠相比，#P<0.05，##P<0.01；與同性別同基因型6周齡小鼠相比，△P<0.05，△△P<0.01；與同周齡同性別Uox+/+小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。下圖同。

2.4 Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥對小鼠血液生化指標的影響

結(jié)果顯示，Uox-/-小鼠ALB、TBIL和DBIL低于Uox+/+對照小鼠(P<0.05)，UA、CREA、BUN、CHOL和LDL顯著高于Uox+/+對照小鼠(P<0.05，P<0.01)。見表4、圖3。

3 討論

動物模型是開展疾病發(fā)病機制研究與創(chuàng)新藥物研發(fā)的基石。目前高尿酸血癥動物模型主要為禽類和嚙齒類，造模方法有促進尿酸生成法、抑制尿酸代謝法及這兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用[9]。然而，這些方法存在需要對小鼠長期使用藥物處理，血尿酸水平波動較大，有的藥物甚至本身就具有腎毒副作用等缺點[10]。為此，課題組構(gòu)建了Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥小鼠模型，該小鼠具有穩(wěn)定的高血尿酸水平，且能夠很好地模擬HUA患者的發(fā)病狀態(tài)，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中的應(yīng)用價值備受關(guān)注，曾被應(yīng)用于動脈粥樣硬化[11]、帕金森病[12]、腎損傷[13]、癲癇[14]等人類疾病機制研究及藥物評價中。本實驗通過檢測幼齡和成年不同Uox基因型C57BL/6 J雌性和雄性小鼠的體重、血壓以及血生理生化指標等基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥能夠?qū)π∈篌w重、血壓、腎功能、脂類代謝以及血生理指標產(chǎn)生影響，為該模型小鼠的使用提供參考。

表2 三種小鼠血壓測量結(jié)果

圖2 三種小鼠收縮壓和舒張壓比較結(jié)果

6周齡雌性Uox-/-小鼠和12周齡Uox-/-小鼠體重均顯著低于Uox+/+對照小鼠，這與臨床觀察到HUA伴隨肥胖的現(xiàn)象相反[3]。與本研究結(jié)果一致，牛效清等[15]發(fā)現(xiàn)通過藥物誘導(dǎo)的HUA模型小鼠體重也明顯低于對照小鼠，可能由于HUA影響妊娠、出生體重及生長發(fā)育所導(dǎo)致[16-17]。

12周齡雄性Uox-/-小鼠和6周齡雌性Uox-/-小鼠血壓明顯高于Uox+/+對照小鼠，與Lu Jie等研究的結(jié)果一致[8]。大量臨床報道及流行病學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HUA是高血壓發(fā)病的獨立危險因素，二者可能存在因果關(guān)系[18]。HUA可通過降低一氧化氮合成和激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)等機制導(dǎo)致人體血壓水平升高[19]。有動物實驗證明給予降尿酸藥物使血尿酸水平達到正常后血壓不再升高[20]，因此Uox-/-小鼠可為進一步研究兩者關(guān)系提供動物模型。

表3 三種小鼠血液生理指標檢測結(jié)果

圖3 三種小鼠UA、CREA、BUN比較結(jié)果

Table4Blood biochemical parameters of the threeUoxgenotypes of mice

周齡Weeks old指標IndicesUox+/+Uox+/-Uox-/-雌Female(n=12)雄Male(n=12)雌Female(n=12)雄Male(n=12)雌Female(n=6)雄Male(n=9)6周齡6 weeksALB(g/L)42.04±3.4637.88±4.52a41.86±1.7337.49±3.47A39.40±3.4437.83±2.15ALT(U/L)28.40±4.4036.00±8.66a36.29±7.97c34.88±11.4238.60±6.66C29.88±5.84aAST(U/L)56.56±9.0452.91±8.7755.38±7.6548.00±6.1361.80±2.0561.14±7.03cAST/ALT2.12±0.421.52±0.33A1.70±0.32c1.69±0.461.64±0.30c2.19±0.32ACTBIL(μmol/L)1.23±0.471.28±0.561.30±0.371.13±0.521.74±0.531.2±0.68DBIL(μmol/L)0.90±0.240.96±0.320.93±0.270.90±0.330.72±0.130.76±0.13IDBIL(μmol/L)0.33±0.310.33±0.290.38±0.210.23±0.311.02±0.47C0.44±0.61GLU(mmol/L)7.24±1.389.46±0.94A8.18±1.488.52±1.757.27±1.228.50±1.84TG(mmol/L)1.23±0.151.47±0.30a0.96±0.04c1.28±0.29a1.00±0.31c1.31±0.47CHOL(mmol/L)2.34±0.332.68±0.18A2.26±0.202.51±0.19a2.41±0.422.68±0.30HDL(mmol/L)1.79±0.352.10±0.17a1.78±0.221.96±0.221.88±0.482.08±0.28LDL(mmol/L)0.38±0.070.37±0.080.40±0.080.39±0.110.48±0.150.51±0.16cBUN(mmol/L)10.77±1.508.06±1.78A7.93±1.89c8.54±2.2017.96±3.08C19.68±8.37CCREA(μmol/L)19.89±4.0423.36±4.1817.00±4.9718.38±5.8527.40±6.66C30.22±8.80CUA(μmol/L)133.10±26.88131.91±35.91110.29±35.62121.13±22.47551.00±116.27C505.13±179.16C12周齡12 weeksALB(g/L)42.69±2.3338.87±2.20A39.69±3.19c38.04±3.33 39.48±3.44c38.56±2.74ALT(U/L)22.42±3.06B34.50±5.44A30.20±5.57C26.92±4.14C21.67±1.63B27.43±4.50aCAST(U/L)48.75±6.73b58.00±6.95A58.00±7.04C48.15±7.88AC49.00±2.76B47.33±3.08BCAST/ALT2.05±0.441.79±0.442.07±0.551.70±0.412.27±0.20B1.85±0.24AbTBIL(μmol/L)1.91±0.63b1.70±0.421.47±0.521.57±0.671.83±0.460.94±0.36ACDBIL(μmol/L)1.25±0.20B1.23±0.330.97±0.22C1.15±0.300.87±0.08bC0.83±0.18CIDBIL(μmol/L)0.66±0.610.47±0.250.50±0.400.42±0.430.97±0.460.11±0.21AcGLU(mmol/L)9.17±1.78b9.75±1.158.26±1.779.37±2.118.48±1.059.39±2.43TG(mmol/L)1.17±0.561.40±0.371.35±0.36B1.31±0.411.28±0.361.16±0.24CHOL(mmol/L)1.96±0.23B2.25±0.18AB1.97±0.542.43±0.21a2.46±0.42c2.79±0.35CHDL(mmol/L)1.74±0.342.11±0.24A1.75±0.482.10±0.26a2.13±0.242.47±0.26abCLDL(mmol/L)0.34±0.110.35±0.060.48±0.11C0.38±0.07a0.40±0.060.37±0.09BUN(mmol/L)9.00±2.00b9.09±1.399.30±1.338.79±1.0621.77±7.82C19.07±9.32CCREA(μmol/L)20.73±2.3320.50±2.8118.91±4.0118.62±2.4327.33±6.31C27.00±4.83CUA(μmol/L)79.64±28.96B138.75±35.69A91.50±26.85126.23±32.65a491.83±62.11C452.86±80.83C

Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥能夠影響小鼠貧血相關(guān)血生理指標。與Uox+/+對照小鼠相比，Uox-/-小鼠RBC、HCT、MCV、RDW-S、HGB和MCH顯著降低，Uox+/-小鼠RBC、HCT和HGB也明顯降低，這與臨床觀察到HUA伴隨血RBC、HCT、HGB和RDW指標升高的現(xiàn)象相反[21]，但也有臨床文獻報道由于腎素基因突變導(dǎo)致出現(xiàn)高尿酸血癥、貧血和慢性腎臟病的表現(xiàn)[22-23]。提示該類指標的變化可能與尿酸氧化酶基因敲除遺傳背景相關(guān)，Uox-/-小鼠模型是否可用于血液學(xué)相關(guān)疾病研究尚待進一步明確。

Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥小鼠UA、CREA和BUN等生化指標顯著高于Uox+/+對照小鼠。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，血尿酸水平升高導(dǎo)致尿酸性腎病、腎結(jié)石和腎功能衰竭的患病率顯著增加[24]。HUA可通過結(jié)晶阻塞腎小管引發(fā)炎癥反應(yīng)及誘導(dǎo)細胞凋亡等機制造成腎結(jié)構(gòu)及功能異常[25]，且病理結(jié)果證實有明顯尿酸鹽晶體沉積于Uox-/-小鼠腎組織[8]。Uox-/-小鼠6周齡就已出現(xiàn)明顯腎功能受損，提示該小鼠是研究尿酸性腎病相關(guān)的理想模型。

Uox-/-小鼠是本實驗室構(gòu)建的國內(nèi)首個基因敲除自發(fā)高尿酸血癥小鼠模型，其生物學(xué)特性尚缺乏系統(tǒng)研究。通過對三種不同Uox基因的C57BL/6 J小鼠體重、血壓及血液生理生化指標進行檢測，明確了Uox-/-自發(fā)高尿酸血癥對小鼠上述指標的影響，為今后生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域利用該動物模型從事疾病尤其是尿酸性腎病發(fā)病機制研究及新型藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。