環(huán)氧二十碳三烯酸通過線粒體途徑保護(hù)缺血/再灌注損傷機制的研究進(jìn)展

葉永才，陳哲璇，李 想，譚偉江，楊豐華*，張良清*

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 湛江 524000；2.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510633)

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是一種常見的病理過程，廣泛發(fā)生于急性心肌梗死、急性腎衰竭、腦中風(fēng)等缺血缺氧性疾病過程[1]。I/R可引起組織器官的損傷和功能障礙，并帶來嚴(yán)重的并發(fā)癥，因而減輕I/R帶來的損傷對患者病情的好轉(zhuǎn)和康復(fù)至關(guān)重要。另外，隨著近年來醫(yī)療水平的提高，器官移植手術(shù)日益增多，如何減少器官移植過程帶來的I/R損傷也是亟待解決的問題。在組織器官I/R損傷中，線粒體因其在生成ATP以及在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)乎細(xì)胞存亡的關(guān)鍵作用而備受重視，許多促生存信號通路作用于線粒體這個終效應(yīng)器來維持細(xì)胞膜的完整性并阻止細(xì)胞死亡[2]，因此，如何維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能成為減輕I/R損傷策略的關(guān)鍵點。

近年的研究結(jié)果表明環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是一種適合治療組織器官I/R損傷的成分。EETs是一類生物活性很強的脂質(zhì)環(huán)氧化合物，已有許多研究證明EETs與心、腦、腎等重要器官的I/R過程密切相關(guān)，其中抗炎、抗凋亡等作用機制在EETs的I/R保護(hù)作用中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，這與EETs介導(dǎo)的抗凋亡機制密切相關(guān)，同時線粒體途徑也是組織器官I/R損傷防治的重要靶標(biāo)，因此線粒體途徑在EETs介導(dǎo)的I/R損傷保護(hù)作用中具有重要地位。然而作為I/R損傷防治的重要靶點，線粒體途徑在EETs介導(dǎo)的I/R損傷保護(hù)作用中卻未得到很深入的探討，并且分子機制仍未完全闡明。本文就線粒體途徑在EETs保護(hù)I/R損傷中的作用進(jìn)行總結(jié)，并指出潛在的研究方向。

1 EETs的生物學(xué)功能

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)是一種廣泛存在于人體內(nèi)的多元不飽和脂肪酸，在體內(nèi)的代謝途徑主要有3種，即環(huán)氧化酶途徑(cyclooxygenase pathway，COX)、脂氧合酶途徑(lipoxygenase pathways，LOX)和細(xì)胞色素P450途徑(cytochrome P450，CYP)。其中AA經(jīng)CYP途徑代謝后會產(chǎn)生EETs，主要包括5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET四種區(qū)域異構(gòu)體[7]。體內(nèi)的EETs可被可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)快速代謝成生物活性低的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeico satetraenoic acids,DHETs)，其許多潛在有益作用也隨著被轉(zhuǎn)化為DHETs而減弱。研究發(fā)現(xiàn)EETs具有擴血管、抗炎、促纖溶、調(diào)節(jié)血管生長等多種生物學(xué)功能。同時，EETs作為許多組織信號通路的重要組成部分能增加細(xì)胞內(nèi)促生存和抗凋亡信號通路的表達(dá)[8-9]。另外研究還發(fā)現(xiàn)抑制sEH的表達(dá)能減少內(nèi)源性EETs的降解，在I/R損傷中起到保護(hù)作用[3-5]，因此提高體內(nèi)EETs 的有效濃度成為研究EETs生物學(xué)作用及機制的研究方法。

2 組織器官缺血/再灌注損傷

組織器官缺血后重新得到血液再灌注在多數(shù)情況下可使組織器官功能得到恢復(fù),但有時缺血后的再灌注反而加重組織器官的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，這種在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織進(jìn)一步的損傷，甚至不可逆性的現(xiàn)象稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[10]。組織器官I/R引起的缺氧會影響細(xì)胞ATP的產(chǎn)生，而ATP作為保證細(xì)胞各項生命活動的能量供應(yīng)者，它的消耗會引發(fā)諸如膜離子泵衰竭、細(xì)胞鉀外流、細(xì)胞內(nèi)和線粒體鈣超載等缺血性級聯(lián)反應(yīng)[11]。另外組織器官I/R還會引起活性氧的產(chǎn)生、炎癥細(xì)胞的聚集、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和缺血后毛細(xì)血管無復(fù)流的發(fā)生。這些病理過程的發(fā)生最終會導(dǎo)致線粒體K+通道受損、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放以及線粒體結(jié)構(gòu)異常[12]，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡。

3 EETs防治缺血/再灌注損傷的重要靶標(biāo)：線粒體

EETs作為許多組織信號通路的重要組成部分能增加細(xì)胞內(nèi)促生存和抗凋亡信號通路的表達(dá)[8-9]，能有效減輕組織器官的I/R損傷，其中線粒體是EETs防治I/R損傷的重要靶點。線粒體是具有雙膜結(jié)構(gòu)的廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，它的主要作用是通過線粒體電子傳遞鏈經(jīng)氧化磷酸化以ATP的形式產(chǎn)生細(xì)胞能量，在細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。除能量產(chǎn)生外，線粒體也是活性氧的主要來源[13]，同時還涉及細(xì)胞凋亡、自噬和壞死性細(xì)胞凋亡等細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)[14]，是細(xì)胞存活和死亡的關(guān)鍵。

組織器官I/R時會導(dǎo)致線粒體活性氧的大量產(chǎn)生，過量的活性氧直接導(dǎo)致線粒體呼吸鏈和代謝酶的氧化損傷[15]，同時也會破壞線粒體膜結(jié)構(gòu)并增加mPTP開放[16]。線粒體通透性的增加則會使促凋亡因子向細(xì)胞質(zhì)的釋放增多[17]，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并加劇各種組織器官中I/R誘導(dǎo)的損傷，因此線粒體功能障礙被認(rèn)為是導(dǎo)致組織器官I/R損傷的標(biāo)志之一。研究表明EETs能有效通過抗炎與抗凋亡等作用機制減輕組織器官的I/R損傷[3-6]，其中線粒體途徑在這些機制中起著至關(guān)重要的作用[2]，這提示EETs能通過保護(hù)線粒體減少組織器官的I/R損傷。然而線粒體盡管在EETs介導(dǎo)的I/R保護(hù)作用中的占有重要地位，但相關(guān)保護(hù)作用中卻未得到很深入的探討，并且分子機制仍未完全闡明，這值得我們進(jìn)行深入研究。

4 EETs保護(hù)線粒體免受缺血/再灌注損傷的作用機制

研究表明EETs和sEH抑制劑能有效減輕組織器官I/R損傷引起的線粒體功能障礙。目前人們認(rèn)為EETs主要通過以下幾個途徑來保護(hù)線粒體免受I/R損傷(詳見表1)：①EETs激活線粒體K+通道；②EETs限制mPTP開放；③EETs減少線粒體促凋亡蛋白的激活；④EETs維持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。

4.1 EETs與線粒體K+通道

EETs能夠作用于包括線粒體ATP敏感性鉀(mitochondrial ATP-sensitive K+,mito-KATP)通道和線粒體Ca2+激活的K+(mitochondrial calcium-activated potassium,mito-KCa)通道在內(nèi)的線粒體K+通道來減輕組織器官的I/R損傷。mito-KATP位于線粒體內(nèi)膜上，由內(nèi)向整流鉀通道和ATP 結(jié)合蛋白兩部分組成，其主要功能是將K+轉(zhuǎn)運至線粒體基質(zhì)內(nèi)調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)K+的濃度從而影響線粒體能量代謝，同時還參與線粒體的氧化磷酸化過程進(jìn)而維持線粒體跨膜電位的穩(wěn)定性[18]。研究表明mito-KATP的激活能減少線粒體內(nèi)膜的部分去極化、線粒體鈣超載以及活性氧的產(chǎn)生，從而賦予缺血后組織器官保護(hù)作用[19]。而EETs被證明能激活mito-KATP通道，如在CYP過表達(dá)即內(nèi)源性增高EETs濃度的小鼠中，賦予的心臟保護(hù)作用涉及mito-KATP通道的激活[20]。同時用外源性EETs處理野生型小鼠心肌細(xì)胞也能通過增加線粒體的氧化還原狀態(tài)，表明EETs能激活mito-KATP通道[20]。在進(jìn)一步的EETs調(diào)控mit-KATP機制研究中，Katragadda D 等[21]用mito-KATP的抑制劑5-HD進(jìn)行實驗發(fā)現(xiàn)EETs通過減少線粒體應(yīng)激而起作用，相關(guān)的研究也表明磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信號通路參與了EETs激活mito-KATP通道的過程[22]，但此調(diào)控通路可能不是唯一通路，Sreedhar B[23]等發(fā)現(xiàn)即使PI3K被抑制EETs也能刺激mito-KATP通道的激活，并且在mito-KATP通道阻滯劑作用下也會發(fā)生PI3K-Akt的激活，提示在EETs調(diào)控mito-KATP通道的保護(hù)作用中有更加復(fù)雜的信號調(diào)控機制，有待進(jìn)一步的研究探討。

mito-KCa通道也是線粒體K+離子通道的一種，mito-KCa通道可以通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高和膜去極化被激活,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞線粒體K+的攝取，減少Ca2+流入引起的線粒體Ca2+超載，提示mito-KCa通道的激活在組織I/R損 傷中具有保護(hù)作用[24]。進(jìn)一步的研究表明天然缺失mito-KCa通道使得組織更容易受到I/R損傷[25]。EETs被證明能激活mito-KCa通道，如Katragadda D 等[21]用mito-Kca通道抑制劑PAX 處理心肌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它消除了EETs對缺血組織的保護(hù)作用，但EETs通過什么途徑作用于mito-KCa通道并不清楚。有證據(jù)表明PKA或PKC在涉及K+通道的I/R損傷保護(hù)途徑中起重要作用[26]，那么PKA或PKC通路很可能是EETs激活mito-KCa的一種機制，這需要進(jìn)一步的實驗來確定EETs介導(dǎo)的I/R損傷保護(hù)作用是否涉及PKA或PKC向線粒體的早期激活或共定位。

4.2 EETs與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔

mPTP是線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由ATP合酶的二聚體構(gòu)成，是細(xì)胞死亡的關(guān)鍵效應(yīng)器，在正常生理條件下mPTP保持閉合，它的開放受基質(zhì)親環(huán)蛋白D(cyclophilin D,CyPD)的調(diào)節(jié)[27]。組織器官I/R時，由于細(xì)胞缺乏氧供，線粒體代謝功能會受到抑制進(jìn)而引起線粒體Ca2+超載、氧化應(yīng)激、腺嘌呤核苷酸消耗和線粒體去極化等不良反應(yīng)，在這些不良反應(yīng)作用下mPTP持續(xù)開放。mPTP的開放會允許> 1.5×103的分子自由通過，這引發(fā)細(xì)胞滲透壓的變化和氧化磷酸化的解偶聯(lián)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[28]。EETs被證明能抑制mPTP的開放從而減輕組織器官I/R損傷，如Katragadda D等[21]發(fā)現(xiàn)EETs能減少由氧化應(yīng)激引起的H9C2心臟細(xì)胞線粒體內(nèi)膜電位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)的損失和mPTP的開放，同時也指出EETs介導(dǎo)的保護(hù)作用可能通過限制ΔΨm的損失減緩mPTP的開放，并有研究指出EETs可能通過PI3K-AKT信號通路來影響ΔΨm以達(dá)到限制mPTP的開放[29]。進(jìn)一步的mPTP開放的機制研究表明，AMP依賴的蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)的內(nèi)在激活對于防止在再灌注期間過量的線粒體活性氧產(chǎn)生和隨后的JNK信號傳導(dǎo)至關(guān)重要，能夠限制mPTP的開放進(jìn)而減輕不可逆的線粒體損傷[30]。由于EETs能通過激活A(yù)MPK和增強Akt的核轉(zhuǎn)位來減輕心臟肥大[31]，提示我們EETs很可能通過激活A(yù)MPK 信號通路進(jìn)而限制mPTP的開放，從而減輕組織器官的I/R損傷。

表1 EETs保護(hù)線粒體免受I/R損傷的途徑及作用機制

隨著近年來高通量細(xì)胞實時成像技術(shù)的發(fā)展，研究者可以更好的對一些細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。最近一項研究通過同時對500至1000個單獨的線粒體進(jìn)行實時成像，發(fā)現(xiàn)mPTP的激活機制涉及瞬時低電導(dǎo)開口，被稱為MitoWinks[32]。這種MitoWinks能通過重置單個線粒體以限制線粒體基質(zhì)鈣超載，進(jìn)而以較小的能量成本來促進(jìn)線粒體和細(xì)胞存活[32]，但EETs是否會引起MitoWinks還有待研究，這可能是未來研究EETs通過線粒體途徑保護(hù)組織器官I/R機制的一個新焦點。

4.3 EETs與線粒體促凋亡蛋白

細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑即線粒體相關(guān)途徑在組織器官I/R損傷過程中發(fā)揮重要的作用，其中線粒體外膜上的促凋亡蛋白扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)用EETs預(yù)處理缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)細(xì)胞以及利用具有EETs模擬特性和sEH抑制特性的新型雙功能化合物UA-8處理小鼠離體心臟都能夠減弱細(xì)胞的凋亡[33-34]。有趣的是有報道指出EETs可以激活PI3K/Akt信號通路并防止肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[35]，提示EETs在組織器官I/R中可能是通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)途徑發(fā)揮抗凋亡作用，這在Wenshu C等[36]的研究中得到證實。他們通過肺組織I/R模型，發(fā)現(xiàn)肺組織缺血會導(dǎo)致線粒體功能障礙和NADPH氧化酶的激活，導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生進(jìn)而調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和激活Caspase-3來觸發(fā)細(xì)胞凋亡過程。同時I/R誘導(dǎo)的這些有害作用會通過CYP過表達(dá)或外源性增加EETs處理而減弱，并且CYP和EETs的保護(hù)作用會被被PI3K-Akt抑制劑LY294002阻斷，表明EETs的保護(hù)作用至少部分通過PI3K-Akt途徑調(diào)節(jié)位于線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白的表達(dá)進(jìn)而在組織I/R損傷中發(fā)揮抗凋亡作用[36]。但是細(xì)胞凋亡涉及非常復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路，提示我們可以關(guān)注其它相關(guān)信號通路，例如最近有研究發(fā)現(xiàn)EETs可以通過靶向JNK/c-Jun信號通路抑制氧葡萄糖剝奪對腦微血管平滑肌細(xì)胞凋亡的作用[37]，那么EETs是否也通過JNK/c-Jun信號通路調(diào)節(jié)線粒體途徑發(fā)揮組織I/R損傷的保護(hù)作用，這可能也是未來研究的一個方向。

4.4 EETs與線粒體結(jié)構(gòu)完整性

線粒體的結(jié)構(gòu)由外至內(nèi)可劃分為線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)四個功能區(qū)。其中線粒體內(nèi)膜向內(nèi)皺褶形成線粒體嵴，是許多生化反應(yīng)的重要場所。線粒體的結(jié)構(gòu)完整性一旦受到破壞就會引起線粒體功能的障礙。研究發(fā)現(xiàn)EETs能夠保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)的完整性維持線粒體的正常功能。El-Sikhry等[38]在HL-1心肌細(xì)胞饑餓模型中,通過評估ADP/ATP比率和氧化呼吸能力發(fā)現(xiàn)，EETs在心肌細(xì)胞饑餓脅迫期間能增加OPA-1寡聚體水平和線粒體嵴密度，保留線粒體功能，延長細(xì)胞對饑餓應(yīng)激的應(yīng)答的存活期，揭示了EETs在調(diào)節(jié)線粒體中的新作用。Akhnokh等[39]利用sEH 敲除鼠和對應(yīng)的野生型小鼠進(jìn)行心梗造模，并用sEH抑制劑tAUCB治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn) tAUCB治療或sEH缺乏可以通過減少EETs的降解顯著減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷從而改善心肌梗死后的收縮和舒張功能，同時還發(fā)現(xiàn)抑制sEH會使線粒體酶活性顯著改善，進(jìn)而說明EETs可以保留缺血性損傷后的線粒體功能。然而EETs如何將保護(hù)信號傳達(dá)到線粒體并保持其結(jié)構(gòu)的完整性并未探索明白。有研究認(rèn)為小窩蛋白1(Caveolin-1，Cav-1)可能起到一個信號傳達(dá)的作用，Chaudhary等[40]從I/R的野生型小鼠心臟中分離出心肌細(xì)胞的質(zhì)膜和線粒體，結(jié)果顯示其中Cav-1缺失以及細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷的缺乏，而從EETs處理后的心臟中分離的質(zhì)膜和線粒體則存在Cav-1和細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷,提示Cav-1信號傳導(dǎo)可能是EETs介導(dǎo)保護(hù)信號到線粒體從而引起保護(hù)效應(yīng)的一個新機制，但還需更多的研究加以證明。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，EETs能通過調(diào)節(jié)線粒體K+通道、mPTP、線粒體促凋亡蛋白以及線粒體結(jié)構(gòu)的完整性在組織器官I/R損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。作為組織器官I/R損傷防治的重要靶點，線粒體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性的維持一直是研究的重點。而EETs作為一種能保護(hù)組織器官I/R損傷的脂質(zhì)環(huán)氧化物，其對線粒體的作用機制盡管部分已經(jīng)得到闡述，但仍然還有很多未知的機制存在，這就需要我們接下來深入去探索。全面深入了解EETs作用于線粒體的機制對于尋找新的防治方式，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點來保護(hù)組織器官I/R損傷有著重要的意義。