非嚙齒類動物在生殖毒性試驗中的應用進展

張元慧，蔣建東，孔維佳*

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050；2.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京 100050)

隨著醫(yī)療水平的提高，新生兒畸形現(xiàn)象正在逐漸減少，然而不孕不育癥卻愈發(fā)嚴重，據(jù)最新文獻報道，全球范圍內(nèi)大概有20%的人患有不孕不育癥[1]，這引起了人們對生殖毒性研究的重視。生殖毒性是指外源因素(如藥品、食品添加劑、環(huán)境污染物、輻射)對親代生殖功能和子代生長發(fā)育所產(chǎn)生的有害作用[2]，該研究是安全性評價的重要內(nèi)容。在進行生殖毒性試驗時，實驗動物的選擇對于研究具有重要意義，一般會采用兩類動物進行實驗，即嚙齒類動物和非嚙齒類動物。非嚙齒類動物通常會選擇家兔，在一些特殊條件下也會選擇其他動物進行實驗，如犬、小型豬或非人靈長類動物。生殖毒性研究主要根據(jù)受試物的藥代動力學特點、藥理學和毒理學信息進行判斷，通常選擇對受試物的體內(nèi)代謝過程以及毒效學參數(shù)與人體相似的實驗動物[3]。目前，對于非嚙齒類動物在生殖毒性研究中的應用資料較少。因此，本文根據(jù)不同實驗動物的自身特點，對各種非嚙齒類實驗動物模型在生殖毒性研究中的現(xiàn)狀進行總結(jié)，旨在為科研工作者選擇合適的動物模型提供一些參考。

1 家兔

家兔作為生殖毒性研究的動物模型具有很多優(yōu)點：無發(fā)情期，一年四季均可交配繁殖；妊娠期較短，一般為30～33 d；繁殖能力強，每胎產(chǎn)仔數(shù)7～12只[4]。家兔屬于刺激性排卵動物，經(jīng)過交配的刺激后可進行排卵。其胎盤是血竇內(nèi)皮型，與人類的血竇絨毛型胎盤較為相似。生殖道與人類最接近，適用于評價避孕藥和局部用的藥物(如凝膠劑、陰道環(huán)等)[5]。

在對新型左炔諾孕酮和炔雌醇復方避孕貼劑進行安全性評價時，研究人員選用了新西蘭家兔進行實驗，多次給予此避孕帖后家兔的體內(nèi)并未發(fā)生藥物蓄積[6]。Susheela等人[7]在研究飲用水中超標氟化物對生殖功能的影響時，發(fā)現(xiàn)氟化處理可導致家兔精小管退化、抑制精子生成，這與氟化物對人體產(chǎn)生的影響一致。另有研究發(fā)現(xiàn)，在停藥期間給予家兔維生素D和E可以修復氟化物引起的生殖功能損傷[8]，這為超標氟化物引起的不孕不育癥提供了新的治療手段。

家兔由于具有上述優(yōu)點，在生殖毒性試驗中應用最多，積累了豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但家兔是食草動物，對能夠引起消化道功能紊亂的化學物質(zhì)以及抗生素類藥物較敏感，臨床表現(xiàn)難以解釋，因此不適合評價此類物質(zhì)。

2 犬

犬無需借助電刺激等痛苦的采精技術(shù)即可獲得精子，因此常用于精子數(shù)量、成熟度和活力測定的分析研究[9]。目前國際公認的標準實驗用犬為比格犬，其具有體型小，性情溫順，便于實驗操作的優(yōu)點[10]。同時，其生理生化指標穩(wěn)定，實驗結(jié)果的重復性好，遺傳學資料豐富[11]。另外，比格犬易于馴化，能夠采用注射等在其他實驗動物不宜操作的給藥方式[12]。

羥胺基組蛋白去乙?；敢种苿〩Z1006是一種有臨床應用前景的抗癌藥物，研究者選擇了比格犬作為該藥物臨床前毒性評價的動物模型，實驗表明男性生殖道、消化道、呼吸道和血液系統(tǒng)可能是HZ1006的毒性靶點，提示該藥物可能存在一定的生殖毒性[13]。另有研究者發(fā)現(xiàn)犬對谷物中廣泛存在的玉米赤霉烯酮的毒性作用敏感，幼齡雌犬接觸低劑量玉米赤霉烯酮可引起子宮和卵巢功能異常，類固醇激素發(fā)生變化，生育能力下降[14]。

但是，犬是季節(jié)性繁殖動物，只在春秋季發(fā)情，產(chǎn)仔數(shù)量變動較大，每胎2～10只不等，并且存在近親繁殖因素的影響，這些特點均限制了犬在生殖毒性試驗中的應用。已有文獻表明犬對抗高血壓藥物、擬交感神經(jīng)藥物和非甾體抗炎藥物的反應與人體存在較大差異[15]，因此不適用于此類藥物的安全性評價。

3 小型豬

小型豬在生理學和解剖學等方面與人類有很多相似性，具有胎仔數(shù)量多、性成熟時間短等優(yōu)點。動情周期、子宮組織學和精子學資料與人類非常接近[16]。有證據(jù)表明[17]，小型豬對很多人類致畸物質(zhì)敏感，如乙醇、羥基脲、維甲酸、沙利度胺、氨基蝶呤等。相對于其他實驗動物，小型豬對這些化合物的反應性可能更具有參考價值。

在進行維甲酸的致畸作用研究時，研究人員選用了哥廷根小型豬進行實驗，證實了維甲酸的致畸作用非常明顯[18]，該研究結(jié)果顯示，隨著給藥劑量的增加，胎仔畸形發(fā)生率不斷上升，畸形程度也越來越嚴重，且畸形表現(xiàn)與人類的視黃酸胚病(小頜、小耳、腭裂、心臟和胸腺的缺陷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常)極為相似。另外，Hayama等[19]發(fā)現(xiàn)在器官形成期給予孕豬乙嘧啶可導致上腭裂等結(jié)構(gòu)性缺陷，也可引起后肢癱瘓等功能性缺陷。美國食品藥品監(jiān)督管理局在2013年批準上市的新藥阿法替尼[15](主要用于治療晚期非小細胞肺癌和晚期乳腺癌)，在其臨床前安全性評價中，由于犬發(fā)生嚴重的胃腸道反應，研究人員選用了哥廷根小型豬進行安全性評價，表明小型豬在新藥臨床前研究中具有良好的應用前景[20]。

目前，小型豬在生殖毒性評價方面的應用還存在一些局限性。首先，小型豬的體型較大，導致實驗人員的操作難度增加，操作過程中體能消耗較大。其次，目前尚無用于研究的商業(yè)試劑盒[21]，給實驗帶來一定困難。最后，小型豬的胎盤不能轉(zhuǎn)移大分子物質(zhì)，無法用于抗體、疫苗等生物制品的安全性評價。

4 非人靈長類動物

非人靈長類動物與人類的生殖系統(tǒng)具有很多相似性，首先兩者均是單胎妊娠，內(nèi)分泌系統(tǒng)對生殖功能的調(diào)控都是通過下丘腦-垂體-卵巢軸進行[22]，均在更年期階段喪失生育能力。女性的生理周期一般是30 d左右，而雌猴一般是28 d[23]。雌猴生殖道的生理結(jié)構(gòu)，包括輸卵管、子宮和陰道均與人類具有可比性。胎盤的生理結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)移機制等方面也與人類相似[24-25]。

非人靈長類動物在比較胎兒和新生兒發(fā)育能力方面具有極大優(yōu)勢，特別是腦部發(fā)育。與大腦發(fā)育不成熟的嚙齒類動物不同，新生恒河猴在出生時腦白質(zhì)明顯增多，這使得恒河猴成為評估不良妊娠(如胎盤功能不全、胎兒生長受限和子癇前期)導致新生兒認知和行為異常的良好模型[26-27]。

Frias等人[28]通過研究發(fā)現(xiàn)，雌性恒河猴長期接觸尼古丁(接近懷孕女性吸煙者的水平)后，胎盤血流量在短期內(nèi)降低，絨毛組織學異常。然而，聯(lián)合服用抗壞血酸藥物(如維生素C)減輕了這些變化。這些研究表明產(chǎn)前接觸尼古丁對胎盤結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生有害作用，并為補充維生素C可以減弱孕期吸煙的一些不良影響這一發(fā)現(xiàn)提供了新的證據(jù)。

雖然非人靈長類動物生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能與人類最為相近，在生殖毒性研究中具有極大的應用價值，但其價格昂貴，資源稀缺，對于實驗方案設(shè)計和執(zhí)行均有一定挑戰(zhàn)。另外，非人靈長類動物面對極大的動物福利壓力和倫理挑戰(zhàn)，進一步限制了其在此類研究中的應用。

5 斑馬魚

斑馬魚的基因組與人類的基因相似度高達87%[29]，這使其成為人類疾病研究的良好動物模型。在生殖毒性試驗中，斑馬魚具有其他動物無法比擬的優(yōu)點：生殖周期短，每次產(chǎn)卵數(shù)量多，胎仔發(fā)育迅速。個體小，對環(huán)境適應力強，可以減少實驗周期和成本。在早期發(fā)育階段通體透明，便于開展胚胎、胎仔的發(fā)育研究[30-31]。另外，斑馬魚和人類的生殖調(diào)控系統(tǒng)具有高度相似性，這使得研究人員能夠通過研究斑馬魚的重要神經(jīng)元，以及生殖激素及其作用效果來全面地研究和理解人類生殖系統(tǒng)[32-33]。

隨著研究的不斷深入，斑馬魚逐漸成為科學家們評估人類生殖系統(tǒng)潛在危險化合物的良好動物模型，特別是評估環(huán)境污染物。以哺乳動物為主的評估生殖毒性的分析方法耗時、復雜且昂貴，需要進行大規(guī)模的實驗分析[34]。同時，哺乳動物往往需要較高劑量，但環(huán)境中化學物質(zhì)的濃度水平往往較低[35]，從而導致現(xiàn)實環(huán)境的毒性水平無法預測。而微量的化合物在較短的時間內(nèi)就可以進入斑馬魚體內(nèi)，因此斑馬魚可以作為環(huán)境污染物研究的最佳實驗動物模型。此外，斑馬魚易受基因操縱，為研究基因?qū)Ψ敝车挠绊懱峁┝艘粋€新的選擇[36]。

Webster等人[37]將斑馬魚暴露于除草劑草甘膦后，發(fā)現(xiàn)斑馬魚cyp19a1基因的表達上調(diào)、芳香化酶的活性以及卵巢中主要雌激素受體esr1的表達均顯著增加，從而揭示草甘膦對斑馬魚生殖器官的類固醇合成具有破壞作用。Lopes等人[38]在暴露于草甘膦的成年雄性斑馬魚中也觀察到抗氧化基因的上調(diào)和精子運動性降低的現(xiàn)象，這表明草甘膦在誘導睪丸氧化應激方面具有一定作用。這與許多人類細胞體外研究結(jié)果一致[39]，均揭示了草甘膦通過破壞激素合成、抑制芳香化酶活性而使精子和卵子質(zhì)量下降，最終導致胚胎早期發(fā)育階段死亡率上升。

迄今為止，斑馬魚作為生殖領(lǐng)域的研究模型只有十幾年[40]，與其他傳統(tǒng)的高等脊椎動物相比，其生殖系統(tǒng)的基礎(chǔ)資料明顯缺乏，特別是對雄性生殖系統(tǒng)的了解還很有限。另外，斑馬魚是卵生動物，交配方式是體外受精，這與人類的繁殖方式存在巨大差異。

6 小結(jié)

綜上所述，在評價避孕藥、凝膠劑和陰道環(huán)等局部給藥的藥物時可以優(yōu)先考慮家兔作為研究對象。評價孕激素類和生育調(diào)節(jié)藥物時，非人靈長類動物是最好的選擇。斑馬魚適用于評價環(huán)境污染物和作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物。犬不適合評價抗高血壓藥、擬交感神經(jīng)藥和非甾體抗炎藥。小型豬不適合評價抗體、疫苗等大分子藥物。所有動物模型都有其優(yōu)點和局限性，家兔胎仔數(shù)量多、便于操作，但是食草性動物，消化道與人類存在差異。犬生理指標穩(wěn)定、結(jié)果的重復性好，但犬是季節(jié)性繁殖，給實驗設(shè)計帶來較大困難。小型豬對某些致畸物質(zhì)的反應與人類存在相似性，但其胎盤無法轉(zhuǎn)移大分子物質(zhì)。非人靈長類動物是單子宮、有月經(jīng)周期，但價格昂貴、資源稀缺、動物福利壓力大。斑馬魚與人類基因高度一致，在發(fā)育前期通體透明、便于觀察，但斑馬魚是卵生動物，繁殖方式與人類存在一定差異。因此，在研究人類生殖毒性時，并沒有單一的理想動物模型，應根據(jù)受試物的理化性質(zhì)、與人體的相互作用以及實驗動物的特點進行綜合考量，選擇最適合的動物模型，在一定條件下也可采用多個動物模型進行評價。