高通量測序在膿毒癥患者病原體檢測和治療中的應(yīng)用

曹燕　劉易林　李莉　李曉勇　孫燁　鐘利民　謝恒　劉科成

[摘要]目的 探討高通量測序技術(shù)在膿毒癥患者病原體檢測和治療中的應(yīng)用價值。方法 選取2016年7月～2019年3月我院重癥監(jiān)護病房（ICU）收治的92例膿毒癥患者作為研究對象，按照隨機數(shù)字表法將其分為觀察組（47例）和對照組（45例）。對照組給予常規(guī)血液培養(yǎng)進行病原體檢測，觀察組在常規(guī)血液培養(yǎng)的基礎(chǔ)上聯(lián)合高通量測序進行病原體檢測。比較兩組的病原體檢測情況（病原體陽性率、病原體報告時間及病原體檢出類型）、治療情況及ICU治療期間并發(fā)癥的發(fā)生情況。結(jié)果 64例患者病原體檢測陽性，其中觀察組45例，陽性率為95.7%;對照組19例，陽性率為42.2%。觀察組的病原體陽性率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組的病原體報告時間為（2.2±0.3）d，對照組的病原體報告時間為（2.6±0.4）d;兩組的病原體報告時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。經(jīng)ICU治療后，73例患者存活，其中觀察組43例存活，存活率為91.5%，對照組30例存活，存活率為66.7%;觀察組的存活率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組的ICU治療時間為（10.5±2.1）d，對照組的ICU治療時間為（18.1±1.2）d。觀察組的ICU治療時間短于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在ICU治療期間，兩組的急性腎損傷、低血壓和急性肺損傷發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 在膿毒癥病原體檢測和治療過程中應(yīng)用高通量測序技術(shù)效果良好，可顯著提高膿毒癥病原體檢測陽性率，縮短膿毒癥患者在ICU的治療時間，同時可明顯改善膿毒癥患者的治療預(yù)后，值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞]高通量測序;血液培養(yǎng);膿毒癥;病原學(xué)

[中圖分類號] R631? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）11（c）-0008-04

Application of high-throughput sequencing in the pathogenic detection and treatment of patients with sepsis

CAO Yan? ?LIU Yi-lin? ?LI Li? ?LI Xiao-yong? ?SUN Ye? ?ZHONG Li-min? ?XIE Heng? ?LIU Ke-cheng

Department of Critical Care Medicine， Yuebei People′s Hospital， Yuebei People′s Hospital Affiliated to Shantou University Medical College， Guangdong Province， Shaoguan? ?512026， China

[Abstract] Objective To investigate the application value of high-throughput sequencing （HTS） in the pathogenic detection and treatment of patients with sepsis. Methods A total of 92 patients with sepsis treated in intensive care unit （ICU） of our hospital from July 2016 to March 2019 were selected as the research object. According to the of random number table method， the patients were divided into the observation group （47 cases） and the control group （45 cases） .The control group was treated with conventional blood culture （BC） for the pathogenic detection， and the observation group was treated with conventional BC combined with HTS. The pathogen detection （pathogen positive rate， pathogen reporting time and pathogen detection type）， treatment status and complications during ICU treatment were compared between the two groups. Results The pathogens were positive in 64 patients， including 45 cases in the observation group， 95.7% in the control group and 19 cases in the control group， with a positive rate of 42.2%. The positive rate of pathogen in the observation group was higher than that in the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The pathogen reporting time of the observation group was （2.2±0.3） d， and the pathogen reporting time of the control group was （2.6±0.4） d. There was no significant difference in the reported time of pathogens between the two groups （P>0.05）. After ICU treatment， 73 patients survived， of which 43 patients survived in the observation group， the survival rate was 91.5%， and 30 patients in the control group survived with a survival rate of 66.7%. The survival rate of the observation group was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The ICU treatment time of the observation group was （10.5±2.1） d， and the ICU treatment time of the control group was （18.1±1.2） d. The ICU treatment time of the observation group was shorter than that of the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the incidence of acute kidney injury， hypotension and acute lung injury between the two groups during ICU treatment （P>0.05）. Conclusion The application of HTS in the detection and treatment of patients with sepsis has good clinical effects. It can significantly improve the positive rate of pathogen detection， shorten the treatment time in ICU， and improve the prognosis of sepsis patients. It is worthy of clinical application.

[Key words] High-throughput sequencing; Sepsis; Pathogenic detection; Treatment

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克，甚至導(dǎo)致患者死亡[1-2]。菌血癥是膿毒癥的主要致病因素之一，但并非所有的血流細(xì)菌感染都會導(dǎo)致膿毒癥，除細(xì)菌之外，真菌、病毒、寄生蟲等其他病原體均可導(dǎo)致患者嚴(yán)重感染及膿毒癥。目前，膿毒癥的病原學(xué)診斷主要依賴于血液培養(yǎng)（blood culture，BC），同時BC在臨床上依然被認(rèn)為是診斷膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時長，診斷陽性率較低，且并非所有的病原體都能被培養(yǎng)出，尤其對于已使用過抗生素的患者，陽性率明顯降低，使得BC具有明顯的局限性，對膿毒癥患者造成不必要的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，甚至死亡[3-4]。近年來，高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS），又稱二代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS），可以使病原體在檢測前不需培養(yǎng)分群即可直接測序鑒別，具有檢測速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋范圍廣等特點，在臨床病原學(xué)診斷和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[5-6]。目前，HTS應(yīng)用于膿毒癥病原學(xué)診斷和治療的前瞻性研究報道少見。本研究旨在探討HTS在膿毒癥患者病原學(xué)診斷及指導(dǎo)膿毒癥抗感染治療中的應(yīng)用價值，為膿毒癥的臨床診治提供參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年7月～2019年3月我院重癥監(jiān)護病房（intensive care unit，ICU）收治的92例膿毒癥患者作為研究對象，采用前瞻性臨床對照研究方法，按照隨機數(shù)字表法將其分為觀察組（47例）和對照組（45例）。觀察組中，男30例，女17例;年齡9～82歲，平均（64.8±14.6）歲;病情嚴(yán)重程度;普通膿毒癥40例，重度膿毒癥5例，膿毒性休克2例。對照組中，男28例，女17例;年齡11～84歲，平均（65.4±14.9）歲;病情嚴(yán)重程度;普通膿毒癥39例，重度膿毒癥4例，膿毒性休克2例。兩組患者的性別、年齡、病情嚴(yán)重程度等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床診斷確診為膿毒癥患者[1];②首次入住ICU;③自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤;②近半年內(nèi)接受過免疫抑制劑治療;③不配合研究者。所有患者及其家屬知情同意本研究并簽署知情同意書。本研究所涉及的研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，并獲得粵北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

對照組給予常規(guī)BC進行病原學(xué)檢測，觀察組在常規(guī)BC的基礎(chǔ)上聯(lián)合HTS進行病原學(xué)檢測。患者入ICU后，在靜脈應(yīng)用抗菌藥物抗感染前，嚴(yán)格按照采血流程及規(guī)范，采取對照組患者10～20 ml血液標(biāo)本送至我院檢驗科行BC進行病原學(xué)檢測，觀察組在對照組基礎(chǔ)上另抽取5～10 ml血液樣本保存于4℃環(huán)境中，由快遞寄往深圳華大基因研究所進行HTS。兩組膿毒癥患者行BC后即予注射用亞胺培南西司他丁鈉（瀚暉制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20067765，生產(chǎn)批號18040401，規(guī)格1.0 g/瓶，q 8 h）聯(lián)合注射用萬古霉素（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，國藥準(zhǔn)字H20033366，生產(chǎn)批號117190505，規(guī)格0.5 g/瓶，q 12 h）抗感染治療，同時兩組患者均給予膿毒癥常規(guī)治療，包括針對原發(fā)病的治療、液體復(fù)蘇、營養(yǎng)支持、控制血糖、預(yù)防應(yīng)激性潰瘍及對癥支持治療。待BC及HTS檢測結(jié)果報告后予抗感染藥物。如對照組患者BC結(jié)果提示陰性，則再次抽血行HTS。所有膿毒癥患者抗感染治療連續(xù)1周后，再次采血行BC或HTS（復(fù)查），如患者感染得到控制，病情穩(wěn)定，同時一次HTS陰性或連續(xù)兩次BC陰性后，予出院或轉(zhuǎn)入其他?？七M一步治療相關(guān)疾病，患者出ICU后均連續(xù)隨訪不少于3個月，每次隨訪詳細(xì)了解患者感染有無加重或復(fù)發(fā)、生活質(zhì)量及并發(fā)癥情況。

1.3觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較兩組的病原體檢測情況（病原體陽性率、病原體報告時間及病原體檢出類型）、治療情況及ICU治療期間并發(fā)癥的發(fā)生情況。

①病原學(xué)檢測陽性率=病原體陽性例數(shù)/該組患者總例數(shù)×100%;②病原體報告時間指患者的病原體檢測結(jié)果報告日期-采血日期，d）;③病原體檢出類型包括：細(xì)菌、真菌、病毒及其他微生物;④患者的并發(fā)癥情況包括急性腎損傷、低血壓及急性肺損傷。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組患者病原體檢測情況的比較

92例膿毒癥患者中，觀察組患者45例病原體檢測陽性，對照組患者19例病原體檢測陽性。觀察組患者的病原體陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。兩組患者的病原體報告時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。兩組患者的細(xì)菌、真菌和其他微生物檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但觀察組患者的病毒檢出率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.2兩組患者治療情況的比較

經(jīng)ICU治療結(jié)束后，觀察組患者出院3例，轉(zhuǎn)科40例，存活43例;對照組患者出院1例，轉(zhuǎn)科29例，存活30例。觀察組患者的存活率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。觀察組患者的死亡率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;觀察組患者的ICU治療時間明顯短于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（表2）。

2.3兩組患者ICU治療期間并發(fā)癥發(fā)生情況的比較

兩組患者在ICU治療期間的急性腎損傷、低血壓和急性肺損傷發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

3討論

膿毒癥是指明確或可疑的感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征[1，7]。隨著人口老齡化的加劇、腫瘤發(fā)病率上升及侵入性醫(yī)療手段的增加，膿毒癥的發(fā)病率不斷上升，全球每年新增數(shù)百萬膿毒癥患者。國外流行病學(xué)結(jié)果顯示，膿毒癥發(fā)病率為0.3%，約9%發(fā)展成嚴(yán)重膿毒癥，3%發(fā)展為膿毒性休克，是導(dǎo)致ICU患者死亡的主要原因之一[8-9]。嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克是ICU面臨的重要臨床問題。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者治療前，血清中降鈣素原（PCT）和C反應(yīng)蛋白（CRP）水平高于非膿毒癥感染患者，同時，嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者PCT和CRP水平高于膿毒癥患者（P<0.05）。通過PCT和CRP聯(lián)合動態(tài)檢測，可提高膿毒癥診斷的敏感度和特異度，同時有助于判斷膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度[10-11]。膿毒癥的治療重在及時，如在入院1 h內(nèi)得到正確的診治，患者的存活率將達到80%以上;而患者在6 h之后才被診治，患者的生存率即會下降至30%[12]。膿毒癥的早期抗感染治療非常重要，2014年《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》強調(diào)，患者應(yīng)在入院1 h內(nèi)開始有效的靜脈抗感染藥物治療[1]。如何合理使用抗菌藥物，既縮短抗菌藥物應(yīng)用時間，又不降低治療有效率，是目前臨床工作中面臨的主要問題。目前臨床上膿毒癥的病原學(xué)診斷主要依賴于BC，但耗時長，陽性率較低，且并非所有的病原體都能被培養(yǎng)出，具有明顯的局限性[3-4]。

如何早期、快速、準(zhǔn)確地查找出膿毒癥患者感染的病原體，實施早期精準(zhǔn)的抗感染治療，是長期困擾ICU醫(yī)生的一個難題。自2016年7月開始，本研究采用HTS對傳統(tǒng)的膿毒癥病原學(xué)診斷方法進行了改良，在常規(guī)BC的基礎(chǔ)上聯(lián)合HTS，取得了良好的結(jié)果。觀察組患者的病原體檢測陽性率達95.7%，明顯高于單純BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，本研究結(jié)果提示，BC聯(lián)合HTS可明顯縮短膿毒癥患者在ICU的治療時間，觀察組的ICU治療時間明顯短于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，本研究結(jié)果進一步提示，BC聯(lián)合HTS可明顯改善膿毒癥患者的治療預(yù)后，觀察組患者的存活率達91.5%，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在膿毒癥患者的病原學(xué)診斷中，BC聯(lián)合HTS可明顯提高病原體檢測的陽性率，這可能與HTS從整體上把握病原微生物群體的組成情況，也可獲得含量低的病原序列，并通過未知序列鑒定新物種有關(guān)，可以迅速識別各類病原微生物，使診斷時間縮短，診斷結(jié)果更加精確[13]。HTS目前可檢測出約2700余種病原體，包括細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體、立克次體，具有檢測速度快、準(zhǔn)確率高、成本低、覆蓋度廣及產(chǎn)出巨大等特點[5-6]，特別是病毒，支原體、衣原體等少見病原體類型的病原學(xué)診斷，HTS較BC而言具有更加獨特和明顯的優(yōu)勢[7，14-15]。在膿毒癥患者的治療中，BC聯(lián)合HTS可明顯縮短膿毒癥患者在ICU的住院治療時間，同時可明顯改善患者的治療預(yù)后，這可能與HTS能快速準(zhǔn)確地查找出膿毒癥患者感染病原體，指導(dǎo)ICU醫(yī)生實施早期精準(zhǔn)的抗感染治療有關(guān)，從而能在較短的時間內(nèi)有效控制患者的感染，降低嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克的發(fā)生率，同時降低急性腎損傷、急性肺損傷等并發(fā)癥的發(fā)生率[16-18]，從而提高膿毒癥患者的存活率，縮短膿毒癥患者在ICU的治療時間。

綜上所述，在膿毒癥病原學(xué)診斷和治療過程中應(yīng)用高通量測序技術(shù)效果良好，可顯著提高膿毒癥病原體檢測陽性率，明顯縮短膿毒癥患者在ICU的治療時間，同時可明顯改善膿毒癥患者的治療預(yù)后，值得臨床推廣。

[參考文獻]

[1]中華醫(yī)學(xué)會重癥醫(yī)學(xué)分會.中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）[J].中華內(nèi)科雜志，2015，54（6）：557-581.

[2]Ramsamy Y，Hardcastle TC，Muckart DJJ.Surviving sepsis in the intensive care unit：the challenge of antimicrobial resistance and the trauma patient[J].World J Surg，2017，41（5）：1165-1169.

[3]Waterfield T，Maney JA，Hanna M，et al.Point-of-care testing for procalcitonin in identifying bacterial infections in young infants：a diagnostic accuracy study[J].BMC Pediatr，2018，18（1）：387.

[4]Candel FJ，Borges Sá M，Belda S，et al.Current aspects in sepsis approach.Turning things around[J].Rev Esp Quimioter，2018，31（4）：298-315.

[5]Dubourg G，Lamy B，Ruimy R.Rapid phenotypic methods to improve the diagnosis of bacterial bloodstream infections： meeting the challenge to reduce the time to result[J].Clin Microbiol Infect，2018，24（9）：935-943.

[6]Long Y，Zhang Y，Gong Y，et al.Diagnosis of sepsis with cell-free DNA by next-generation sequencing technology in ICU patients[J].Arch Med Res，2016，47（5）：365-371.

[7]Rello J，Valenzuela-Sánchez F，Ruiz-Rodriguez M，et al. sepsis：A review of advances in management[J].Adv Ther，2017，34（11）：2393-2411.

[8]Shrestha G，Mulmi R，Joshi N，et al.Prevalence of sepsis and possible severe bacterial infection among neonates in nepal[J].J Nepal Health Res Counc，2018，16（1）：1-5.

[9]Thompson K，Venkatesh B，F(xiàn)infer S.Sepsis and septic shock：current approaches to management[J].Intern Med J，2019，49（2）：160-170.

[10]王國榮.血清降鈣素原聯(lián)合C-反應(yīng)蛋白在膿毒癥診斷中的應(yīng)用價值分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2018，25（9）：126-128.

[11]黃影蘭，黃培銘，歐少佳，等.降鈣素原和C反應(yīng)蛋白在膿毒癥治療中的應(yīng)用分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2019，26（18）：75-77.

[12]Prescott HC，Angus DC.Enhancing recovery from sepsis：a review[J].JAMA，2018，319（1）：62-75.

[13]Grumaz S，Stevens P，Grumaz C，et al.Next-generation sequencing diagnostics of bacteremia in septic patients[J].Genome Med，2016，8（1）：73.

[14]Al Rwahnih M，Rowhani A，Westrick N，et al.Discovery of viruses and virus-like pathogens in pistachio using high-throughput sequencing[J].Plant Dis，2018，102（7）：1419-1425.

[15]Thoendel M，Jeraldo P，Greenwood-Quaintance KE，et al.A novel prosthetic joint infection pathogen，mycoplasma salivarium，identified by metagenomic shotgun sequencing[J].Clin Infect Dis，2017，65（2）：332-335.

[16]Bellomo R，Kellum JA，Ronco C，et al.Acute kidney injury in sepsis[J].Intensive Care Med，2017，43（6）：816-828.

[17]Andrews B，Semler MW，Muchemwa L，et al.Effect of an early resuscitation protocol on in-hospital mortality among adults with sepsis and hypotension：a randomized clinical trial[J].JAMA，2017，318（13）：1233-1240.

[18]Wang PQ，Li J，Zhang LL，et al.Identification of key metabolites for acute lung injury in patients with sepsis[J].Iran J Public Health，2019，48（1）：77-84.

（收稿日期：2019-08-08? 本文編輯：焦曌元）